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單細胞凝膠電泳標準操作規程
發布時間：2021-07-27瀏覽次數：1081返回列表
在細胞核中，DNA是環狀附著在核基質上，細胞裂解過程中，核基質被溶解、抽提，DNA的結構則未發生變化。
如果DNA鏈上存在缺口，則使DNA超螺旋變的松弛，DNA環向外展，同時由于暴露了陰電荷，在電場力的作用下，松動的DNA環向陽極遷移，但是由于這種松動的DNA環一端仍附著于核DNA，其遷移距離受到限制，因此尾長并不總是真實反映鏈缺口的多少。實際應當依靠尾長與尾部的熒光強度同時來進行分析。
操作步驟：
1、分離制備單細胞懸液：
（1）體外培養的細胞株：用胰酶消化，吹打成單細胞懸液
（2）體內臟器細胞：處死動物，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個細胞懸液。
2、膠板制備：
（1）取20～50μl于56℃水浴中保溫的0.5%普通熔點瓊脂糖，鋪于磨沙載玻片上，形成底膠。
（2） 取100～150μl 0.5%普通熔點瓊脂糖加在底膠上，再于其上加蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
（3） 取下蓋片，取50～100μl于37℃水浴中保溫的1.0%的低熔點瓊脂糖與50～100μl細胞懸液（105個細胞/ml）混勻，立即鋪片，加上蓋玻片，4℃冷凝10分鐘。
（4）去掉蓋玻片，取70～100μl于37℃水浴中保溫的0.5%的低熔點瓊脂糖鋪片，加蓋玻片，4℃冷凝。
3、細胞裂解與電泳：
（1）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預冷的細胞裂解液中，4℃裂解1小時。
（2）取出膠板，放入電泳槽中，浸泡在電泳液中解旋20分鐘。
（3）4℃電泳20分鐘（25V，300mA）。
4、中和與染色：
（1）電泳結束，將膠板浸泡于中和液中，每次15分鐘，共中和兩次，注意換中和液。
（2）取出膠板，置于染色架上，滴加5μg/ml的PI，暗處染色20分鐘。
（3）蒸餾水脫色15分鐘。
5、鏡檢和分析：
（1）在熒光顯微鏡下觀察，綠光激發吸收濾片590nm。必要時照相記錄。
（2）記數觀察的細胞，記錄彗星細胞出現的頻率，用目鏡測微尺測頭長與全長，計算核DNA遷移距離。
使用兩層凝膠法，經裂解、DNA解旋、電泳和中和得到濕瓊脂糖凝膠片。將濕瓊脂糖凝膠片置于冰冷無水乙醇中脫水10分鐘，后置于空氣中自發干燥。每人制備2張瓊脂糖凝膠片。全部操作在采血后8小時內完成，操作過程中注意避光。
脫水干燥的瓊脂糖凝膠片裝于含有干燥劑的載片盒中運回實驗室。使用50?l 30?M的溴乙錠溶液染色、照相。使用單細胞凝膠電泳軟件分析所有照片，每人隨機測量100個以上細胞的尾長和olive尾矩，以尾長和olive尾矩的算術均數代表個體DNA損傷情況
