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RNA的免疫共沉淀分離及檢測實驗
發布時間：2021-05-31瀏覽次數：1065返回列表
非編碼RNA的發現使得RNA領域再次成為了生命科學研究關注的焦點。因為RNA是一種不穩定的生物大分子，絕大多數的RNA都需要與特定的RNA結合蛋白質結合形成RNA/蛋白復合物才能穩定存在于細胞中；不僅如此，RNA與RNA結合蛋白之間的動態關聯貫穿和伴隨了RNA的轉錄合成、加工和修飾、胞內運輸和定位、功能發揮及降解的整個生命循環。鑒于此，利用RNA結合蛋白分離或發現鑒定功能性RNA分子是RNA研究領域中一個不可或缺的研究方法。簡單地說，就是利用RNA結合蛋白的抗體免疫沉淀RNA/蛋白復合物，再從沉淀的RNA/蛋白復合物中分離得到特定RNA結合蛋白的RNA;分離得到的RNA可以通過末端標記和變性膠電泳對RNA分子的大小進行鑒定，也可以利用高通量RNA測序方法對RNA序列進行分析。
●全部所用的溶液試劑均經過DEPC處理或由DEPC水配制。
●RNA抽提過種中乙醇漂洗步驟可以省略。
●RNA樣品溶解與保存:TE（pH8。0）緩沖液。80℃（如果下一步操作涉及酶反應）de-ionicFormamide（如果下一步是電泳檢測）
●熟練的RNA操作非常重要。RNase的污染可通過使用RNAZap處理操作環境得到降低。
1. 由組織或細胞裂解液免疫沉淀RNP復合物
（1）可預先UV照射組織和細胞固定RNA/結合蛋白復合物。
（2）使用預先冰浴冷卻的PBS洗組織或細胞兩次。
（3）將裂解液加入組織樣品中進行勻漿（細胞樣品勻漿步驟可省略）。裂解液：
25 mmol/L Tris-HClpH7.5，150 mmol/L KCl，2 mmol/L EDTA，0.5%NP40，1 mmol/L NaF，1 mmol/L DTT，100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制劑，EDTA-free蛋白酶抑制劑。
（4）樣品裂解液在4℃下14000 r/min（16000 g）離心10 min，上清液將用于免疫沉淀。
（5）將預平衡的ProteinA/GSepharosebeads與適量的抗體混勻，于4℃旋轉混勻6 h左右。
（6）將第3步驟中準備的上清液樣品加入beads-抗體混合液中于4℃旋轉混勻6 h以上或過夜。結合時間也取決抗體本身的質量和效率。
（7）將混勻液于4℃，1000 r/min離心10 s，棄上清液，用冰浴冷的低鹽漂洗液洗beads兩次，每次5 min，冰上或4℃進行。隨后再用高鹽漂洗液洗beads兩次，每次5 min，冰上或4℃進行。低鹽漂洗液：（高鹽漂洗液使用300 mmol/L的NaCl）50 mmol/L Tris-HClpH7.4，150 mmol/L NaCl（300 mmol/L），1 mmol/L MgCl2，0.05%NP40，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，100 U/ml RNasin核糖核酸酶抑制劑。
2. 小分子RNA的抽提
（1）用ProteinaseK溶液重懸beads，55℃消化10 min。
（2）再用常規的TRizol法抽提RNA，用乙醇沉淀。
3. RNA5'端標記和電泳檢測
（1）用CalfIntestinalPhosphatase處理抽提得到的RNA，以去掉5'端磷酸基團。
（2）經酚氯-仿抽提和乙醇沉淀后，使用γ-32PATP標記RNA分子的5'末端。
（3）將標記后的RNA分子通過15%聚丙烯-酰胺尿素變性膠進行電泳分離，隨后經放射自顯影進行檢測
