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蛋白質的(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳制備
發布時間：2021-04-14瀏覽次數：1258返回列表
一．試劑制備：
1.分離膠緩沖液（pH8.9）:36.6gTris,48ml1mol/l的HCl,或先加水至80ml,用濃HCl調pH，再定容至100ml.
2.濃縮膠緩沖液（pH6.7）：5.98gTris,48ml1mol/l的HCl, 或先加水至80ml,用濃HCl調pH，再定容至100ml.
3.30%丙烯酰胺（pH≤7.0）：29g丙烯酰胺和1g甲叉雙丙烯酰胺，溶于60ml水中，加熱至37?C溶解，補水至100ml，用棕色瓶貯存于室溫，幾個月后重新配置。
4.10％過硫酸銨（W/V）：1g溶于10ml水中，4?C保存數周，盡量現用現配。
5.四甲基乙二胺(TEMED)
6.10％SDS。將10gSDS溶于80ml重蒸水中并輕緩攪拌（室溫低時需水浴加熱溶解），再定容至100ml,室溫存放。
7.樣品緩沖液：5ml1mol/l的Tris-HCl（pH6.7），2.5gSDS,1ml巰基乙醇，0.05g溴酚蘭，10g蔗糖，加水定容至100ml。
8．考馬斯亮藍染色液：0.25g考馬斯亮藍R-250用少量甲醇溶解后，用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀釋至100ml。
9．脫色液：90ml甲醇:水（1:1）和10ml冰醋酸配成100ml脫色液
10．Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：在900ml去離子水中溶解15.1gTris堿，94g甘氨酸，加入50ml10％（W/V）的電泳級SDS貯液，用去離子水補至1000ml量則成5×貯液。
二．電泳
1.用1％瓊脂將長玻璃板下端封住，冷凝30分，灌12％分離膠（4.9ml蒸餾水，6.0ml30％丙烯酰胺，3.8ml1.5mol/lTris-HCl,150μl10%SDS, 150μl 10%過硫酸銨, 6μl TEMED），灌到至短玻璃板4cm，用水封住，冷凝30分后將水倒出，吸干，灌滿5％濃縮膠（5.5ml蒸餾水，1.3ml30％丙烯酰胺，1.0ml1.5mol/lTris-HCl,80μl10%SDS, 80μl 10%過硫酸銨, 8μl TEMED）后立即插入梳子，冷凝30分后取出梳子，將1×電泳緩沖液倒入電泳槽，并淹沒短玻璃板
2.取30μl蛋白提取液與30μl樣品緩沖液混合，于100℃水浴加熱3min使蛋白變性，用微量進樣器以50μl的量注入點樣孔，不加樣槽注入樣品緩沖液。
3．以濃縮膠中100V，分離膠中180V電壓進行電泳，至距底線1cm時關閉電源
4.將電泳后的凝膠取出，置于培養皿中，用蒸餾水沖去殘留緩沖液，加入染色液將凝膠完全浸泡其中，放入微波爐內，高火檔照射20秒，停留1min，再照射10秒，反復幾次至凝膠上色后倒出染色液，用蒸餾水沖去殘留染色液，加入脫色液，高火檔照射20秒，倒出脫色液，再加入新鮮脫色液照射20秒，重復5－6次，直至背景清晰透明，于凝膠分析儀上成像分析。
