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微載體培養(yǎng)技術(shù)介紹
發(fā)布時(shí)間：2020-11-06瀏覽次數(shù)：1227返回列表
（一）概述
微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。
微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的zui有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，放大容易。
目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞。
微載體是指直徑在60.250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第1種微載體問世以來，國(guó)-際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達(dá)十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯飽沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodexl、2、3、Cytopore和Cytoline。
增大單位體積內(nèi)表面積（S/F)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。微載體直徑盡可能小，zui好控制在100-200μm之間。培養(yǎng)體系內(nèi)微載體的密度一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。
（二）微載體培養(yǎng)原理與操作
1．微載體培養(yǎng)原理
將無(wú)細(xì)胞毒性的微載體顆粒加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，使細(xì)胞在微載休表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細(xì)胞在徽載體表面上的增殖，要經(jīng)歷戮附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。豁附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞能否在微載體表面豁附，主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。
2．微載體培養(yǎng)操作
攪拌轉(zhuǎn)速由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作是，在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停。數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，zui大速度75r/min。
細(xì)胞與微載體的相融性好壞，與微載體表面的理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，因靜電斥力使細(xì)胞難于赫附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。
影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要有三個(gè)方面：①培養(yǎng)細(xì)胞方面，如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。②微載體特性方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子。徽載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。③培養(yǎng)液組成及其特性，如培養(yǎng)基組成、沮度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件zui優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快，反之生長(zhǎng)速度慢。
微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn)：①培養(yǎng)初期。保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中晚期細(xì)胞至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，geng高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。②貼壁階段。3-8d后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。③培養(yǎng)維持期。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液。換液時(shí)，停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入37℃新鮮培養(yǎng)液，重新開始攪拌。④收獲細(xì)胞。首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，75-125r/min快速攪拌20-30min。然后解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。
可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行微載體培養(yǎng)的放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。
（三）微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)
微載體培養(yǎng)由于表面積／體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高。把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)。可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微珠表面的生長(zhǎng)情況。簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好。培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的利用率較高。容易放大，細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜，勞動(dòng)強(qiáng)度小，培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積
