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雙熒光素酶檢測的原理和應用
發布時間：2020-11-05瀏覽次數：1263返回列表
一、熒光素酶報告基因的檢測原理
熒光素酶（Luciferase）是生物體內催化熒光素(luciferin)或脂肪醛(firefly aldehyde)氧化發光的一類酶的總稱，來自于自然界能夠發光的生物。
自然界存在的熒光素酶來自螢火蟲、發光細菌、發光海星、發光節蟲、發光魚、發光甲蟲等。細菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細胞的應用中受到限制。目前，以北美螢火蟲蟲(Photinus pyralis)來源的熒光素酶基因應用的zui為廣泛，該基因可編碼550個氨基酸的熒光素酶蛋白，是一個61kDa的單體酶，無需表達后修飾，直接具有完全酶活。
發光機制
生物熒光實質是一種化學熒光。螢火蟲熒光素酶在Mg2+、ATP、O2的參與下，催化D2熒光素(D2luciferin) 氧化脫羧，產生激活態的氧化熒光素，并放出光子，產生550～580 nm 的熒光，其化學反應式如下。
這種無需激發光就可發出偏紅色的生物熒光，其組織穿透能力明顯強于綠色熒光蛋白(GFP)。熒光素酶是靠酶和底物的相互反應發光，特異性很強，靈敏度高，由于沒有激發光的非特異性干擾，信噪比也比較高。
二、熒光素酶報告基因的檢測流程
1、重組質粒制備: 制備含有待檢測基因-Luc/Rluc的重組質粒；
2、細胞系選擇: 根據實驗需要選擇細胞株，通常選擇轉染效率較高的293T細胞或原代細胞等；
3、共轉染: 將帶有Luc/Rluc標記的報告基因和目的基因進行共轉染，設置不同的檢測時間點，一般為24h/48h；
4、外界干預: 轉染后，可進行物理/化學/病毒等的相應刺激；
5、細胞處理: 采用進口/國產雙熒光素酶檢測試劑盒依照protocol操作；
6、熒光檢測: 使用GENios Pro 酶標儀或具有類似檢測功能的設備進行熒光強度檢測。
三、熒光素酶報告基因的優點
1、優越的靈敏度，比Westernbloting靈敏度高1000倍以上；
2、內源性低，哺乳動物無內源性表達；
3、熒光素酶檢測不受細胞內其他物質影響；
4、發光檢測，檢測方便；
5、靈敏度高，10‐20摩爾熒光素酶分子；
6、檢測范圍廣，大于7個數量級。
四、主要應用領域
1、潛在啟動子/啟動子核心區域檢測；
2、潛在增強子/抑制子等調控子核心元件檢測；
3、啟動子區可能的轉錄因子結合位點檢測；
4、啟動子/增強子與轉錄因子的相互作用；
5、病毒/細胞相互作用；
6、藥物等化學誘導因素對啟動子活性的調節（抑制或增強）；
7、射線等物理誘導因素對啟動子活性的調節（抑制或增強）。
五、熒光素酶報告基因檢測方法與Western-Blot檢測方法在細胞信號轉導通路調控機制研究中的區別
1、熒光素酶報告基因檢測是測定上游刺激對下游靶基因在轉錄水平的影響，即對靶基因mRNA表達水平的影響，可以通過實時熒光定量PCR來驗證；Western blot是測定上游刺激對下游靶基因對應的蛋白表達水平的影響，特別是磷酸化程度的改變。因此，兩方面的實驗結果可以結合起來geng細致、geng全面地揭示細胞信號轉導調控的分子機制。
2、熒光素酶報告基因檢測方法操作過程相對簡單，檢測靈敏度較高；Western blotting操作過程繁瑣，檢測靈敏度較低。
3、熒光素酶報告基因檢測只需要成功將含有目標DNA序列插入到報告載體中，即可進行后續實驗，Western blotting則需要購買商品化的一抗，一般價高量少，且抗體的雜交條件需要摸索；若自制的一抗，抗體效價需要驗證，實驗周期較長
