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PCR實驗室污染方式及處理
發布時間：2020-10-19瀏覽次數：1055返回列表
有實驗室的地方，就不可避免的會出現實驗室污染。實驗室的污染，不僅會影響實驗與科研的質量和效果,還對實驗室工作人員的身體健康有損害，今天小編就和您一起了解下PCR實驗室的污染原因及解決方法。
PCR實驗室污染
標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
PCR擴增產物污染：這是PCR反應中zui主要zui常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大，遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。
實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見，因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
污染監測
一個好的實驗室，要時刻注意污染的監測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對照試驗
1、陽性對照：在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。
2、陰性對照：每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照：被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。
3、重復性試驗
4、選擇不同區域的引物進行PCR擴增
☆ 防止污染的方法
進行PCR操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規程，zui大程度地降低可能出現的PCR污染或杜絕污染的出現。
劃分操作區：目前，普通PCR尚不能做到單人單管，實現完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區域內進行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區內進行：
1. 試劑準備區。
2．標本制備區。
3. PCR擴增區及分析區。
切記：任何一間的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA：
1．PCR用水應為高壓的雙蒸水；
2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產物區配制；
3．引物和dNTP應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發生污染時查找原因。
PCR實驗操作注意事項
盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環節都應該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即geng換手套；
2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；
3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻geng換手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精-確度；
5. zui后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；
6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應的可靠性，又可以協助判斷擴增系統的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器zui容易受產物氣溶膠或標本DNA的污染，zui好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區；
8. 重復實驗，驗證結果，慎下結論
