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質(zhì)粒提取過(guò)程中遇到的10大基本困惑！
發(fā)布時(shí)間：2020-09-10瀏覽次數(shù)：1465返回列表
是不是在質(zhì)粒提取過(guò)程中總會(huì)碰到提取的質(zhì)粒濃度不夠或者純度不夠的情況？
其實(shí)經(jīng)常提質(zhì)粒之后，會(huì)發(fā)現(xiàn)提質(zhì)粒是一項(xiàng)非常簡(jiǎn)單且基本的實(shí)驗(yàn)操作。但如果真問(wèn)起一些質(zhì)粒提取的一些細(xì)節(jié)，可能很多人回答不了。不信隨我看看。
首先，質(zhì)粒的提取可分為質(zhì)粒小提、質(zhì)粒中提、質(zhì)粒大提。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都選用試劑盒方法來(lái)提取質(zhì)粒，可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，來(lái)選擇相應(yīng)的試劑盒。
質(zhì)粒小提主要是對(duì)于1ml-5ml的大腸桿菌菌液中質(zhì)粒DNA進(jìn)行小量提取，獲得的質(zhì)粒用來(lái)進(jìn)行常規(guī)的載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)。
而質(zhì)粒中提，是在質(zhì)粒小提的基礎(chǔ)上進(jìn)一步去除菌液中的內(nèi)毒素，獲得的質(zhì)粒可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，常規(guī)需要菌液量為10-15ml。
質(zhì)粒大提與中提方法相同，一次可對(duì)100ml-200ml菌液進(jìn)行抽提，從而獲得大量質(zhì)粒。
10大問(wèn)題，幫您解決在質(zhì)粒提取過(guò)程中遇到的zui基本的困惑
1.質(zhì)粒制備的基本原理是什么？
在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，大多數(shù)人都做過(guò)質(zhì)粒提取，但并不是所有的人都知道質(zhì)粒制備的基本原則。
堿裂解法是提取質(zhì)粒zui常用的方法。
質(zhì)粒先是被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后挑選單菌落接種到含有特定抗生素的培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)的大腸桿菌達(dá)到生產(chǎn)的平臺(tái)期時(shí)（一般為12到16個(gè)小時(shí)），通過(guò)高速離心開始收集大腸桿菌；使用試劑盒的懸浮液把菌體全部重懸并用SDS-NaOH進(jìn)行裂解。
因?yàn)镾DS是一種很強(qiáng)的去污劑，可以把細(xì)胞膜中的蛋白質(zhì)和磷脂抽提出來(lái)，從而使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)得到釋放，而NaOH是強(qiáng)堿，可以讓蛋白質(zhì)、染色體DNA和質(zhì)粒DNA進(jìn)行變性；當(dāng)菌體徹底裂解了以后，再加入酸性醋酸鉀,用來(lái)中和堿性裂解液，同時(shí)變性蛋白質(zhì)、變性基因組DNA和細(xì)胞碎片形成沉淀，但是在上清溶液中，存在正確復(fù)性的質(zhì)粒DNA，通過(guò)離心，可以收集上清溶液。zui后通過(guò)試劑盒的核酸吸附材料，來(lái)對(duì)上清液中的質(zhì)粒DNA進(jìn)行回收。
2.質(zhì)粒DNA制備的關(guān)鍵是什么？
使用堿裂解法制備質(zhì)粒的關(guān)鍵是把握好SDS-NaOH處理菌體的時(shí)間。
如果質(zhì)粒長(zhǎng)時(shí)間處于堿性環(huán)境，就有可能出現(xiàn)不可逆的變性反應(yīng)，使得zui終提取出來(lái)的質(zhì)粒中含有變性質(zhì)粒。這些變性質(zhì)粒，由于不能進(jìn)行酶切反應(yīng)，所以無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3.質(zhì)粒中基因組污染是怎么產(chǎn)生的？
當(dāng)在質(zhì)粒提取過(guò)程中變性和中和的步驟處理不當(dāng)時(shí)，就會(huì)參數(shù)基因組污染。
如果在提取中進(jìn)行溶液混合時(shí)，操作過(guò)于劇烈，就會(huì)導(dǎo)致基因組DNA被剪切成小片段，zui后在中和時(shí)同質(zhì)粒DNA一起復(fù)性保存在上清溶液中，同時(shí)被回收出來(lái)。
4.如何確定質(zhì)粒小抽細(xì)胞的用量？
對(duì)于一般的載體構(gòu)建等常規(guī)實(shí)驗(yàn)，幾微克的DNA就足夠使用了。因此一般小提5ml菌液，都能夠滿足要求。
如果使用過(guò)量的細(xì)胞，由于試劑盒的限制，會(huì)很難把菌液裂解等，而且DNA的純度和得率并不會(huì)顯著提高。所以對(duì)于需要大量的質(zhì)粒時(shí)，因考慮geng換提取試劑盒或者按比例提高各溶液的用量。
5.電泳分析抽提的質(zhì)粒會(huì)看到什么？
如果是制備出來(lái)純度非常差的質(zhì)粒，那么從電泳加樣孔往下，您看到的條帶依次是基因組DNA，開環(huán)環(huán)裝質(zhì)粒（opencircularplasmid），超螺旋質(zhì)粒(SuperCoiled)，變性的超螺旋質(zhì)粒（denaturedsupercoiledplasmid），細(xì)菌RNA。
高質(zhì)量質(zhì)粒膠圖主要部分為超螺旋質(zhì)粒，沒(méi)有RNA等的污染。
6.質(zhì)粒制備的得率是由哪些因素決定的？
屬主細(xì)胞類型、大腸桿菌的數(shù)量、質(zhì)粒的拷貝數(shù)和提取過(guò)程中使用純化方式（試劑盒類型）。
7.您的質(zhì)粒需要什么樣的純度？
同樣對(duì)于一般的載體構(gòu)建等常規(guī)實(shí)驗(yàn)和送去測(cè)序檢測(cè)的話，用手工和試劑盒制備的DNA都能達(dá)到要求。
如果是質(zhì)粒需要用來(lái)做細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的話，則需要無(wú)熱源，無(wú)內(nèi)毒素（LPS）。
8.為什么酶切鑒定“有插入片段”的
質(zhì)粒測(cè)序卻發(fā)現(xiàn)是空的？
產(chǎn)生這種現(xiàn)象的zui主要的原因是提取質(zhì)粒的過(guò)程中產(chǎn)生了變性的超螺旋質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶無(wú)法對(duì)它進(jìn)行酶切。所以在判斷酶切效果時(shí)通過(guò)電泳進(jìn)行分析，變性的超螺旋質(zhì)粒常常被誤認(rèn)為是酶切下來(lái)的片段，導(dǎo)致誤判。其實(shí)只需要在酶切后的電泳分析增加一個(gè)原始質(zhì)粒進(jìn)行對(duì)照就可以避免誤判。
9.如何判定DNA的純度和濃度？
使用試劑盒抽提的質(zhì)粒DNA，可以通過(guò)儀器檢測(cè)OD260和OD280濃度，通常OD260/OD280的比值在1.7-1.8之間。估算質(zhì)粒濃度可以通過(guò)瓊脂糖電泳來(lái)判斷會(huì)geng準(zhǔn)確一些。
10.為什么有些純化的質(zhì)粒時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)發(fā)生降解？
如何解決？
產(chǎn)生這個(gè)問(wèn)題的原因有很多，主要還是因?yàn)楹怂崦傅奈廴尽?br />
除了在質(zhì)粒提取過(guò)程中會(huì)帶入核酸酶外，根據(jù)有關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒屬主細(xì)胞的種類也會(huì)影響到抽提質(zhì)粒的質(zhì)量。如果提取的質(zhì)粒需要長(zhǎng)期保存，可以使用內(nèi)含豐富的核酸酶活性的大腸桿菌，比如DH5α,DH1,HB101等
