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樣本制備完成了，可流式細胞術語還沒弄清楚？
發布時間：2020-06-10瀏覽次數：1483返回列表
流式細胞術( Flow cytometry, FCM)是一種可以對細胞或亞細胞結構進行快速測量的分析技術和分選技術。與一般的技術相比，流式細胞儀分析時會涉及到各種參數，對于剛入門的我們，常常搞得焦頭爛額。如下圖（來自網絡）僅僅流式分析數據圖都是多種多樣（一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等）。所以，今天就為大家科普一下，流式細胞儀中那些常見術語。
01、流式細胞儀常見術語
1. 設門（gate）：
劃定某一區域的細胞群體，對其單獨加以分析或分選。舉例來說，如下左圖，以FSC為橫坐標，SSC為縱坐標，圈出想進行分析的細胞主群（設門），雙擊圈內，看FL4(APC)為橫坐標，FL2(PE)為縱坐標，進行分析。下中圖為陰性對照，由此可以圈出陰性群的范圍，在下右圖中就可以劃分出APC單陽、PE單陽、APC&PE雙陽的細胞群。
2. FL1、 FL2、 FL3、FL4通道：
在某些機型的流式細胞儀中存在，是指不同的熒光通道。舉個例子，我們用FITC/PE雙標記的細胞，在488nm的激光激發下，這兩種熒光染料分別發出波長不同的綠色和橙色熒光，然后將發出的熒光再通過濾光片分開，對應的是不同的波長的濾光片，一般在FL1通道是530nm的濾光片，在FL2通道是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。
3. FL2-W FL2-A FL2-H ：
流式細胞儀檢測信號時，每一個細胞通過激光，機器的探頭都會檢測到一個熒光信號，在內部產生一個電脈沖信號（波），這個信號機器記錄為一個峰值，每一個峰值都有三個參數，高度（H），寬度（W）和曲線下面積（A），H 和W都是直接測出的，而A是根據機器的設置就算得出。
4. APC、PE、PE-Cy7、PerCP-Cy5.5等：
這些名詞均為常見的熒光素，在受激發后能產生熒光。
5. 調補償：
若兩種以上的熒光素的發射光譜之間存在重疊，則需要調補償。這就意味著一種熒光素發出的光可能被另一種熒光素的檢測器檢測到。調補償主要指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發射光譜重疊的過程，去除干擾熒光信號。如下為補償調節原則：
①用于調節補償的標本必須單染。
②樣本必須可以染出一群陽性和一群陰性，以比較它們之間的平均熒光強度。
③可以使用同一熒光的另一抗體替換目的抗體來調節補償（例如在稀有細胞檢測時）。
④使用表達強度高的抗體來調節補償。
⑤用來調節補償的抗體必須與實驗用的抗體熒光素一樣（例如不能用FITC調節GFP的補償）。
⑥串聯染料的抗體如果批號不同，需要再次做補償。
⑦陰性和陽性細胞的自發熒光水平必須一致。
⑧有些抗原表達弱，陽性群不明顯，例如IFN-γ-PE，可以用補償微球代替細胞。
6. MFI值：
即為平均熒光強度。每個細胞經過流式細胞儀檢測都會有一個相對強度的熒光值。陰性細胞沒有特異性熒光，也會發生很微弱的自發熒光，因此有很小的熒光強度；陽性細胞的特異性熒光強度是陰性細胞熒光強度的幾百甚至幾千倍。MFI就是把所有細胞的熒光強度相加再除以細胞數，就是所有細胞熒光強度的一個平均值。一般來說，百分比越高MFI就高，百分比低相應MFI就低，有時候兩個樣本百分比相處不多看不出差別時，MFI就能很好地反應這種微弱的差異。
7. 染色：
用帶有不同熒光基團的抗體分別結合細胞上不同的抗原。熒光素偶聯抗體的標記（染色）包括表面染色和胞內染色：
①表面染色
②胞內染色
8. 基線偏移：
通過增加隨機的高斯正偏移把一些低水平信號的對數數據從比較低的數字通道上移上來，方便數據間的分析。
02、常見的技術指標
1. 儀器的分辨率：
分辨率是衡量儀器測量精度的指標，通常用變異系數CV (Coefficient of Variation)表示。DNA 流式分析中的分辨率（或精que性）非常重要，因為細胞群體之間DNA 含量的細微差別可能有顯著的生物學意義。通常，分辨率由標準微球DNA 分布中的G0/G1 峰的變異系數CV來反映（CV%=（SD/Mean）×100）。儀器因素（如液流、光路調試和光學元件等）、樣本制備和染色過程帶來的人為因素都可能影響檢測的精que性。評估真正的生物學意義上的DNA 含量差別因而具有geng重要的價值。如何zui大限度地減少樣本制備和儀器因素帶來的變異是DNA 分析條件zui佳化的根本所在。DNA 直方圖中峰的CV 越低，質量越好，從圖中可能獲得的信息越多。新鮮標本的CV 常比石蠟包埋的標本好。新鮮標本的CV 常≤3%，而石蠟包埋的標本CV 則取決于組織病理實驗室的具體操作方法，通常到≤5%。當G1 峰的CV≥8%時，不再合適估計S 期比例。
2. 熒光測量靈敏度：
靈敏度的高低是衡量儀器檢測微弱熒光信號的重要指標，一般以能檢測到單個微球上zui少標有FITC 或PE 熒光分子數目來表示，一般現在FCM 均可達到<600個熒光分子，兩個細胞間的熒光差＞5%即可區分。
3. 前向角散射光(FSC, Forward Scatter)檢測靈敏度：
前向角散射光檢測靈敏度是指能夠檢測到的zui小顆粒大小，一般目前商品化的FCM 可以測量到0.2-0.5μm 左右。
4. FCM 分析速度：
分析速度以每秒可分析的細胞數來表示，當細胞流過光束的速度超過FCM 儀器響應速度時，細胞產生的熒光信號就會被丟失，這段時間稱為儀器的死時間（Dead time）。死時間越短，我們就說這臺儀器處理數據越快，一般可達到3000個/秒~6000個/秒左右，FACS Calibur 的分析速度為10000個/秒，大型機已達到每秒幾萬個細胞。
5. FCM 分選指標：
分選指標主要包括：分選速度、分選純度及分選得率。分選速度指每秒可提取所要細胞的個數，目前常用的臺式分選儀器BD公司生產的FACS Calibur的分選速度為300個/秒，BD大型機的流式細胞儀zui高分選速度可達每秒上萬個細胞。分選純度指被分選出細胞所占的百分比，一般臺式機和大型機的分選純度均可達到99%左右。分選得率是指被分出細胞與原來溶液中該細胞的百分比。通常情況下，分選純度和得率是互相矛盾的，同一樣品，純度提高，得率降低，反之亦然。這是由于樣品在液流中并不是等距離一個接著一個有序地排著隊，而是隨機的，因此，一旦兩個不同細胞挨得很近時，在強調純度和收獲率不同條件下，儀器會作出取舍，因此，選擇純度還是得率要視具體實驗要求而定。
6. 背景（噪聲、熒光、散射）Background (noise, fluorescence, scatter)：
當樣品流中沒有顆粒時卻仍存在的信號（背景噪聲是限制熒光檢測靈敏度的一個因素）。背景信號會有不同的主要來源：當激光器關閉，或流動室沒有光激發時，檢測器噪聲是主要的背景信號來源。對于光電倍增管（PMT），檢測器背景噪聲被稱為暗電流，主要來自光電陰的電子的隨機發射。對于光電二管和其他固態檢測器，主要來源于倍增器。熒光噪聲源包括：水和光學元件的拉曼散射來自樣品或鞘流中未結合的熒光染料、試劑或污染物的熒光光學組件的熒光。
03、Tips
①控制好孵育時間：熒光淬滅操作中的孵育時間一定要嚴格，孵育時間過長會導致熒光淬滅，如將試管放入冰中，可以延遲淬滅；
②注意染色順序：遇到多種熒光染色時，可能會因為染色順序的不同而導致熒光強度不同。處理方法：提前進行預實驗，嘗試多種順序，選擇zui佳染色順序
③合適的染色方案：選擇不合理的染色方案也會導致熒光信號太弱。處理方法：提前進行預實驗，設計好zui佳染色方案
④做好陰性對照及同型對照：試驗細胞陰性對照可以顯示細胞基準的熒光水平。同型對照則是為了查看抗體非特異性結合的水平。選擇同型對照需要注意采用相同物種、相同亞類、相同染料、相同濃度，否則，檢測的時候會出現亂七八糟的同型對照結果。
⑤選擇合適的抗體：為表達zui弱的抗原選擇染色指數zui高的熒光素。根據使用的流式細胞儀性能、激光器、濾光片種類來選擇。對于多色實驗，需選擇發射光譜重疊小的染料。
