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質粒DNA的堿裂解法提取與純化 @古朵實驗
發布時間：2020-04-14瀏覽次數：1349返回列表
細菌質粒是一類雙鏈、閉環的DNA，大小范圍從1kb至200kb以上不等。各種質粒都是存在于細胞質中、du立于細胞染色體之外的復制的遺傳成份，通常情況下可持續穩定地處于染色體外的游離狀態，但在一定條件下也會可逆地整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代。
質粒已成為目前zui常用的基因克隆的載體分子，重要的條件是可獲得大量純化的質粒DNA分子。目前已有許多方法可用于質粒DNA的提取，本實驗采用堿裂解法提取質粒DNA。
堿裂解法是一種應用zui為廣泛的制備質粒DNA的方法，其基本原理為：當菌體在NaOH和SDS溶液中裂解時，蛋白質與DNA發生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態，離心時留在上清中；蛋白質與染色體DNA不變性而呈絮狀，離心時可沉淀下來。
純化質粒DNA的方法通常是利用了質粒DNA相對較小及共價閉環兩個性質。例如，氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心、離子交換層析、凝膠過濾層析、聚乙二醇分級沉淀等方法，但這些方法相對昂貴或費時。對于小量制備的質粒DNA，經過苯酚、lv仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等簡單步驟去除殘余蛋白質和RNA，所得純化的質粒DNA已可滿足細菌轉化、DNA,PIAN段的分離和酶切、常規亞克隆及探針標記等要求，故在分子生物學實驗室中常用。
一、試劑準備
1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高壓滅菌15min ，貯存于4℃。
2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前臨時配置。
3. 溶液Ⅲ：醋酸鉀（KAc）緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存備用。
4. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。
5.苯酚/lv仿/異戊醇（25：24：1）
6.乙醇（無水乙醇、70%乙醇）
7. 5×TBE：Tris 堿54g，硼酸27.5g，EDTA-Na2·2H2O 4.65g，加ddH2O 至1000ml。15 lbf/in2高壓濕熱滅菌20min，4℃保存備用。
8．溴化乙錠（EB）：10mg/ml
9.RNase A（RNA酶A）：不含DNA酶(DNase-free) RNase A的10mg/ml，TE配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。
10. 6×loading buffer（上樣緩沖液）：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%（W/V）蔗糖水溶液。
11. 1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g瓊脂糖于三角燒瓶中，加100ml 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加EB母液（10mg/ml）至終濃度0.5靏/ml（注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套），輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中（電泳緩沖液0.5×TBE），即可上樣。
二、操作步驟
1. 挑取LB固體培養基上生長的單菌落，接種于2.0ml LB（含相應抗生素）液體培養基中，37℃、250g振蕩培養過夜（約12-14hr）。
2.取1.5ml培養物入微量離心管中，室溫離心8000g×1min，棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。
3.將細菌沉淀重懸于100靗預冷的溶液Ⅰ中，劇烈振蕩，使菌體分散混勻。
4.加200靗新鮮配制的溶液Ⅱ，顛倒數次混勻（不要劇烈振蕩），并將離心管放置于冰上2-3min，使細胞膜裂解（溶液Ⅱ為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。
5.加入150靗預冷的溶液Ⅲ，將管溫和顛倒數次混勻，見白色絮狀沉淀，可在冰上放置3-5min。溶液Ⅲ為中和溶液，此時質粒DNA復性，染色體和蛋白質不可逆變性，形成不可溶復合物，同時K+使SDS-蛋白復合物沉淀。
6.加入450靗的苯酚/lv仿/異戊醇，振蕩混勻，4℃離心12000g × 10min。
7.小心移出上清于一新微量離心管中，加入2.5倍體積預冷的無水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，4℃離心12000g×15min。
8.1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀在室溫下晾干。
9.沉淀溶于20靗 TE（含RNase A 20靏/ml），37℃水浴30min以降解RNA分子，-20℃保存備用。
三、質粒DNA的電泳檢測
觀察瓊脂凝膠中DNA的zui簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色。該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm和366nm有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區的590nm處重新發射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。
取制備的質粒DNA 1-2靗，加適當loading buffer混勻上樣,采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負向正移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測，攝片。
四、注意事項
本裂解法小量制備質粒 DNA重復性好，一般無麻煩。若所提取質粒 DNA不能被限制性內切酶切割，可通過酚/lv仿再次抽提，以清除雜質來解決問題。
