在過去的十年間，分子生物學領域的一部分重要進展來自于單個細胞內全基因組和全轉錄組測序研究。隨著細胞分離和新一代測序的進步，研究人員不再需要分析來自群體中多個細胞的平均信號，而是可以逐個細胞地研究DNA，RNA，蛋白質和染色質。


      單細胞基因組學，表觀基因組學，轉錄組學和蛋白質組學研究揭示出了即使是在同一組織中遺傳相同的細胞之間，基因和蛋白質表達依然存在差異。但是來自美國Parker癌癥免疫療法研究所的生物學家Pier Federico Gherardini指出，目前大多數此類研究只檢查了每個細胞的單層信息，這可能會產生偏差。“你不能只測量RNA，就由此推測蛋白質看起來都一樣。”


       現階段，科學家們已經開始以單細胞分辨率組合多層信息。這些“多組學”技術可以更仔細地觀察細胞之間的可變性，更清楚地識別特定細胞及其功能。分析基因組DNA揭示了單細胞基因組，甲基化組織或染色質，而分析RNA和蛋白質則能分別產生轉錄組和蛋白質組數據。


       “多組學比單一層的組學分析更強大，”英國Sanger研究所的分子生物學家Lia Chappell說，“這樣才能開始解開所有異質性的真正含義，能夠深入挖掘生物機制。”


       維也納CeMM分子醫學研究中心的基因組研究員Christoph Bock認為，單細胞多組學特別適用于檢查發生快速變化的細胞，如活化的免疫細胞，或非常異質組織中的細胞，包括腫瘤。


       這種方法還可以識別在大量群體中被掩蓋的罕見但具有生物學重要性的細胞。 Chappell說：“一個典型的例子是那些抗藥性低的細胞，在群體研究中我們無法找到它們，因為他們被上千倍更多的細胞淹沒了。”


       然而，單細胞多組學研究并不容易。目前對于任何單細胞多組學技術，還沒有可用的商業試劑盒，并且許多技術還存在限制。研究人員必須修改現有的單細胞方案，使其與多種類型的分子兼容，并且要非常小心地將樣品的損失或污染降至zui低。


基因組和轉錄組

       同時對來自相同細胞的DNA和RNA進行測序可以揭示單個細胞之間的基因組變異，解釋其轉錄水平的變化。這樣做還可以更準確地檢測DNA突變。


        DR-seq（DNA-mRNA sequencing）這種測序方法發表于Nature Biotechnology[1]，通過裂解單細胞，并同時擴增裂解物中的DNA和RNA。然后將裂解物分成兩半，一個用于RNA測序（RNA-seq），另一個用于基因組測序。這樣在擴增過程中將DNA和RNA保持在一起，可以zui大限度地減少核酸的損失，但可能會導致潛在的交叉污染。


       G＆T-seq（genome and transcriptome sequencing）則是另外一種重要方法[2]，早在2015年生物通就報道過這種技術（Nature Methods發布重磅測序技術：基因組和轉錄組平行測序），研究人員當時用G&T-seq對220個小鼠和人類細胞進行測序，獲得了空前詳細的信息。


        具體來說，這種技術就是利用涂有結合mRNA的短寡核苷酸序列的磁珠，物理性地從完全裂解的細胞中分離mRNA和DNA。然后將DNA和mRNA分別擴增和測序。這樣讓保持mRNA和DNA分離，允許研究人員使用他們選擇的方案分析每種分子，但這可能導致核酸的損失。 目前G＆T-seq已實現自動化，通量相對較高。


表觀基因組和轉錄組

       分析細胞表觀基因組和轉錄組的技術可以揭示甲基化和染色質可接近性（chromatin accessibility，生物通注）對基因表達的調控作用。


      “在腫瘤發生等復雜的生物過程中，異質性同時存在于基因組，表觀基因組和轉錄組中，單獨分析它們可能不起作用，”北京大學分子生物學家湯富酬教授說。基因相同的腫瘤細胞可能具有不同的DNA甲基化或基因表達模式，可能需要多組學技術才能明確地將它們分類為亞群。


       scM＆T-seq（simultaneous single-cell methylome and transcriptome sequencing）能同時完成單細胞甲基化組和轉錄組測序分析[3]，這種方法基于G＆T-seq，采用相同的方法從單個細胞中分離DNA和RNA，并擴增和測序RNA。對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理，將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，然后擴增并測序以測定甲基化組。


        研發技術人員表示，“這一新的實驗方案讓你可以并行分析同一單細胞中的DNA甲基化和RNA。我們的方法提供了有關單細胞DNA甲基化異質性與特定基因表達差異之間關系的shou個直觀視圖。”（Nature Methods：突破性單細胞表觀基因組與轉錄組分析新技術）


       scNMT-seq（single-cell nucleosome, methylation, and transcription sequencing）則是在scM和T-seq基礎上發展起來的[4]，不過這種技術需要將單細胞分離出來，進行處理，檢測全基因組染色質可接近性。不同基因組位置的可接近性，或者保護性會影響基因表達，使用scNMT-seq可以發現小鼠胚胎干細胞中表觀基因組和轉錄組之間的新關聯。


      scMT-seq（another method of simultaneously sequencing single cells’ methylomes and transcriptomes）是同時測序單細胞的甲基化組和轉錄組的另一種方法[5]，這種是加州大學范國平教授和同濟大學薛志剛教授研發的，他們利用這種方法對感覺神經元進行研究，揭示了細胞間的轉錄組和甲基化組異質性。不過，這些差異大多不是啟動子甲基化造成的。舉例來說，啟動子帶CpG島的基因，表達水平與基因體甲基化正相關。這項研究表明，scMT-seq可以用來檢測單細胞中的轉錄組、甲基化組和單核苷酸多態性信息，進而解析表觀遺傳學基因調控機制。（同濟大學發布單細胞測序新技術）

       scTrio-seq（single-cell triple omics sequencing是一種單細胞三重組學測序方法[6]，由北京大學湯富酬教授等人研發，這種全新的單細胞三重組學測序方法在上次從同一個單細胞中實現對三種組學高通量測序信息的同時獲取，并從單細胞水平發現肝癌細胞在三種組學上存在密切相互關聯的高度異質性。


       scTrio-seq選擇性裂解細胞膜，將細胞質中的mRNA與完整細胞核中的基因組DNA分開。對于scMT-seq，實驗人員是利用微量移液管收集細胞核，而在scTrio-seq中，則是通過離心分離細胞核。兩種情況中，基因組DNA都是進行的改良亞硫酸鹽處理和測序方法來檢測甲基化組，而來自細胞裂解物的mRNA則是平行擴增和測序。


      “基本上在基因組和轉錄組數據之間沒有交叉污染，”湯教授表示。scTrio-seq使用甲基化組序列數據計算評估基因組拷貝數變異，這種技術已用于分析人結直腸癌樣本中的異質性。


蛋白質組和轉錄組

       還有幾種技術可以同時測定來自單個細胞的轉錄物和蛋白質。這些方法為科學家提供了轉錄后的研究，分析導致蛋白質和轉錄水平之間的差異。


       PLAYR（proximity ligation assay for RNA）技術中，蛋白質被不同金屬同位素的抗體標記。同時，RNA轉錄物被同位素標記的探針結合。利用一種稱為質譜流式細胞技術（mass cytometry）的方法測量同位素，并且這種技術也可以同時檢測每秒數千個單細胞中的40多種不同的mRNA和蛋白質。


       CITE-seq（cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing）采用寡核苷酸標記的抗體靶向細胞表面蛋白。這種技術分離并裂解單個細胞，并將它們的mRNA和寡標記抗體與涂有短寡核苷酸序列的磁珠結合。擴增RNA和抗體標簽并按大小分離，通過測序定量分析蛋白質和轉錄物。CITE-seq還可同時檢測約100種蛋白質以及數萬種RNA轉錄物。


       Marlon Stoeckius是紐約基因組中心的分子生物學家，他是這項技術的研發者。目前Stoeckius正致力于將該方法擴展到細胞內蛋白質，不過這需要固定和透化細胞，這可能會降低RNA質量或導致其從細胞中滲出。


        REAP-seq（RNA expression and protein sequencing assay）類似于CITE-seq，采用寡核苷酸交聯抗體來檢測細胞蛋白質和轉錄物水平（基于測序）。


       REAP-seq和CITE-seq都可以檢測很多的轉錄本，但與PLAYR相比，每次檢測的細胞數量更少。


       “我認為它們是互補的方法，”PLAYR的開發人員Gherardini說，“如果你有一個大的隊列或臨床研究，像PLAYR這樣的東西會更加經濟有效”。


       CITE-seq還有一個優點就是蛋白質定量可以在通常單細胞RNA測序制備中丟棄的部分進行，因此“對RNA測序文庫的質量沒有任何損害，”紐約基因組中心的Peter Smibert說，“我們認為如果采用RNA-seq作為讀數，那么就可以使用CITE-seq。”

     

如何做出選擇

      有了這么多種的檢測方法可供選擇，研究人員還需要根據他們提出的生物學問題，特定技術的成本，勞動密集程度和技術要求來決定使用哪些檢測方法。


      “通常這需要技術團隊，計算人員和了解實驗系統的生物學家合作才能很好地完成這些類型項目的研究，”Bock說。


       如何制定技術方案，選擇方法取決于很多因素，各種技術的實驗指南存在的一大差異是如何從組織中分離單個細胞，口腔移液和連續稀釋是相對快速，簡便和低成本的方法，可以zui大限度地降低RNA或蛋白質降解的風險，但它們通量也相對較低。FACS，機器人操作和微流體是高通量的，但它們很昂貴并且可能在細胞分離上沒有那么精細。


       成本是另一個因素。基于指南和試劑的體積（例如酶和抗體），上述這些技術的價格每個樣品從幾美元到幾百美元不等（這不包括測序的成本，當然測序也可能是限制性的問題）。 “沒有多少科學家能夠從單個細胞中測序十萬個單基因組，”Chappell說。


       對于一批樣品，單細胞多組學測定可以需要花費超過24小時到近一周的時間，其中涉及手動將細胞核與細胞質分離的方法往往較慢，且勞動強度較大，而基于FACS的方法更方便，通量更高。


       生物信息學專業知識是一個。 Stoeckius說：“對于所有的這些分析，你需要一點計算機背景和一些R經驗，”這是一種用于統計計算和數據分析的編程語言和軟件環境。


      不過這種情況也可能很快就會改變，因為越來越多的人開始使用這種分析，一些公司開發了易于使用的軟件來分析單細胞多組學數據。目前，諸如SEURAT和MOFA之類的計算軟件包可以集成來自兩個或多個組學層的數據。


       隨著單細胞單組學技術變得更加靈敏，準確和高通量，相應的多組學技術也可能得到改善。研究人員還致力于將單細胞技術與其它數據層相結合，例如空間信息（如CODEX）和功能分析。將細胞的空間信息鏈接到其他組學層可以幫助研究人員在組織內映射不同的細胞類型和功能。


       zui終的目標還是從單個細胞中捕獲所有分子的信息——一種“”的信息，但這仍然需要幾年時間。目前，單細胞多組學正在改變科學家處理分子生物學的方式。