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大鼠ELISA試劑盒選對，用對，才能事半功倍!
發布時間：2018-09-13瀏覽次數：1627返回列表
大鼠ELISA試劑盒試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被大鼠白細胞介素1β（IL-1β）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠白細胞介素1β（IL-1β）呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。大鼠ELISA試劑盒選對，用對，才能事半功倍!
一、如何選購
查找待測樣本的蛋白濃度：
可以通過NCBI的文獻，uniprot，pax-dab上給出的蛋白表達量參考值來比較ELISA試劑盒中給出的樣本值與報道值是否一致；試劑盒的應用種屬、檢測樣本的種類：除試劑盒特別說明外，一般不同種屬不能通用。常見待測樣本種類有：血清和血漿（不同抗凝劑），細胞上清，和細胞裂解液，試劑盒中不同樣本的稀釋液不混用；
試劑盒的檢測范圍：
也就是標曲范圍，特別要注意待測樣本濃度是否落在標曲范圍內，對于濃度很高的樣本，可以行預實驗摸索到比較好的稀釋倍數后再大量測定樣本。
試劑盒中的稀釋線性及回收率：
a.稀釋線性一般指樣本稀釋線性，是將樣本梯度稀釋下來，看各稀釋梯度濃度是否成線性；參考樣本稀釋線性可以選擇樣本的zui佳稀釋倍數；
b.稀釋線性也有做加標稀釋線性的情況，加標稀釋線性是將標準品加入樣本中測定加入的標準品濃度測定是否準確；同樣也是確定待測樣本稀釋倍數的參考指標。一般線性和回收率的范圍在80%-120%比較合適；
試劑盒的其它指標：
a.靈敏度：試劑盒能夠檢測到的樣本zui低濃度的能力，如果待檢指標含量很低，需要選擇高靈敏度的ELISA試劑盒；
b.板間和板內的變異系數（CV%）:反映板內和不同板之間是否均勻，CV%一般小于10% 比較好。
試劑盒的有效期：
試劑盒的有效期一般是半年至一年，樣本準備時間需要考慮到試劑盒的有效期。
二、ELISA如何使用
樣本的準備：
盡量使用新鮮樣本，不使用有溶血，被細菌污染、標本保存時間過長和標本凝固不全的樣本。ELISA檢測宜采集新鮮標本，如不能立即測定，5天之內應4℃保存，對于1周后檢測的樣本應低溫凍存；做好分裝，長時間凍存的樣本避免反復凍融。
待測樣本加樣：
待檢樣本過多時，建議分批操作；需要稀釋的樣本提前做好稀釋，注意選對合適稀釋液；控制好加樣時間，避免加樣費時過長造成誤差；注意加樣角度，垂直加入孔底，不要接觸孔壁, 做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。
溫育和洗板：
溫育時間和溫度一般根據試劑盒的說明書進行選擇。溫育時可以采用水浴或者濕盒孵育,避免“邊緣效應”。
①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；
②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢。
顯色：
市售大鼠ELISA試劑盒中，一般是以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的顯色液，反應條件為37℃或室溫反應15～30 min。顯色反應需要避光。
讀數和數據分析：
終止后讀取結果盡量在15min內完成，讀取OD值時酶標儀需先預熱15～30 min再進行。數據分析一般用四參數和直線擬合法，選擇哪種擬合方式，可以依據標曲的相關系數（R2）來確定，R2一般需要大于0.99。
