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質粒提取的原理與常見問題
發布時間：2018-04-02瀏覽次數：1345返回列表
現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質粒（＞15Kb）。
堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠遠大于質粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質粒為共價閉合環狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可以恢復其天然構象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA仍在上清中。
質粒是真核細胞細胞核外或原核生物擬核區外能夠進行復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸分子。現在習慣上用來專指細菌(大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用做基因的載體。質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質粒在宿主細胞體內外都可復制。(Vector)(DNA)
目前，已發現有質粒的細菌有幾百種，已知的大多數的細菌質粒都是共價閉合環狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質粒的相對分子質量一般較小，約為細菌染色體的0.5%～3%。根據相對分子質量的大小，大致上可以把質粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質量是40×106以上，較小一類的相對分子質量是10×106以下(少數質粒的相對分子質量介于兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定于質粒本身的復制特性。按照復制性質，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細胞染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細胞內只有1～2個質粒；另一類是松弛型質粒，當染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細胞內一般有20個左右質粒。這些質粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質粒拷貝數增至幾千份。
質粒提取原理
現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法，前兩種方法較為劇烈，適用于較小的質粒（＜15Kb），而去污劑裂解法則比較溫合，一般用于分子量較大的質粒（＞15Kb）。
堿裂解法是一種廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為：染色體DNA遠遠大于質粒DNA，染色體DNA為線狀分子，而質粒為共價閉合環狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環境中，線性的大分子的染色體DNA完全變性，而共價閉環質粒DNA在將PH調至中性后即可以恢復其天然構象，在高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態，通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA仍在上清中。
質粒提取常見問題分析
1、影響質粒提取的因素有哪些？
質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細菌細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。
2、為什么從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶？
革蘭氏陽性菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根據實驗需要選擇不同級別的產品？
從純度上：各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化，普通純度的質粒可以滿足要求；而對于轉染實驗，則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。
從提取的量上：1-20μg，應選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上：分為普通細菌質粒提取試劑盒、G+菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒，根據情況進行選擇。
