ELISA中文全稱是酶聯(lián)免疫檢測吸附試驗， 其核心是抗原抗體固相化及抗原抗體酶標記技術(shù)， ELISA檢測方法間接法、 夾心法、 阻斷法等多種檢測方法，其不同的檢測方法各有優(yōu)劣。同時， 其他的產(chǎn)品組份及操作細節(jié)同樣影響著終的試驗結(jié)果。

1.ELISA試劑盒的選擇

1.1 產(chǎn)品的技術(shù)參數(shù)選擇一個ELISA產(chǎn)品先需要了解的是其技術(shù)參數(shù)，大致包括以下幾個方面。 產(chǎn)品的有效期： 目前市面上的ELISA試劑盒大多均為2-8℃保存，有效期12個月。 產(chǎn)品的包裝規(guī)格：常用的包裝規(guī)格是96T*1/2/5塊板。產(chǎn)品的適用性： 比較理想的產(chǎn)品是同時可以檢測針對同一病種的不同動物血清樣品。

1.2 產(chǎn)品的性能指標ELISA產(chǎn)品屬于免疫檢測試劑，其基礎(chǔ)的性能指標就是： 敏感度、 特異度、（批內(nèi)/批間） 重復(fù)性， 在此基礎(chǔ)上進一步評價的性能指標有：約登指數(shù)、 陽性預(yù)測值、 陰性預(yù)測值、 陽性似然比、陰性似然比、 粗一致性、 調(diào)整一致性、 95％置信區(qū)間等， 但是需要注意的是這些性能指標都是建立在金標準的基礎(chǔ)上的。如果只是兩種檢測方法的對比就需要做一些相關(guān)性統(tǒng)計分析， 如卡方檢驗、 t檢驗、 F檢驗、 Kappa值等， 也可以計算出一些相關(guān)性的性能指標。

1.3 產(chǎn)品的客戶體驗產(chǎn)品的客戶體驗是在客戶使用產(chǎn)品的過程中除了產(chǎn)品性能之外的一些使用的感受。如： 產(chǎn)品包裝的外觀設(shè)計、 產(chǎn)品在運輸后的完整性及整潔性、產(chǎn)品組份的標識是否完整及清楚、 不同產(chǎn)品組份是否容易區(qū)分、 產(chǎn)品操作說明是否簡單易懂、操作步驟是否簡單、 結(jié)果判斷是否容易、 數(shù)據(jù)分析方法及工具等。這些細節(jié)也會影響到使用者對一個產(chǎn)品的整體印象。

2.樣品的采集、 處理及保存

2.1樣品的采集ELISA試劑盒一般是采用動物的血清或血漿進行檢測。在血液標本采集的過程中先是采集的準備工作。 血液采集的時間在不影響生產(chǎn)工作的基礎(chǔ)上選擇血液樣品質(zhì)量好、 采集比較容易的時段，樣品采集數(shù)量或比例的計劃， 樣品采集前的防護工作， 采集器具的準備，如注射器或采血管的容量、 是否需要抗凝血， 采集的數(shù)量、 樣品采集后裝在什么容器里，如何保存、 標識及記錄等。 這些都是需要結(jié)合實際的檢測需求進行準備。

2.2 樣品的處理樣品的處理主要指血清或血漿的分離。 在血清或血漿分離過程中需要注意以下問題：將分離的血清或血漿需要另外一個容器存放， 在更換容器的過程中注意保持編號或記錄的完整及正確。 血清可以離心分離也可以冷藏自然析出，需要注意的是在紅細胞與血清未分離前不可以冷凍，因冷凍后血液中紅細胞會破裂導(dǎo)致溶血， 影響后面實驗的效果。 血漿分離直接離心即可，但是注意離心機的轉(zhuǎn)速和離心的時間， 如果過度離心也會導(dǎo)致紅細胞破裂。

2.3 樣品的保存如果一周之內(nèi)進行檢測， 將分離的血清或血漿樣品存放于2-8℃待檢即可。 如果一周之內(nèi)不進行檢測可將樣品進行-20℃冷凍保存， 若是長期存放可保存于-40℃。 但是需要注意的是反復(fù)凍融會導(dǎo)致血清或血漿中的抗體部分失活，所以根據(jù)實驗的需要可以將樣品進行小體積分裝后保存。

3. 實驗操作

3.1 樣品的稀釋樣品稀釋是ELISA實驗過程中操作影響大的部分之一，因為樣品稀釋大多是手工操作完成。 不同的檢測原理使用的血清濃度有差異， 血清稀釋倍數(shù)從1：1到1：200不等。阻斷法一般使用的血清濃度比較高， 其次是夾心法， 間接法使用的血清濃度比較低。血清稀釋先是采用正確的稀釋倍數(shù)和使用正確的樣品稀釋液， 另外還要注意混勻和防止不同樣品質(zhì)檢交叉污染。如果樣品量比較大可以使用稀釋版進行稀釋， 如果稀釋倍數(shù)比較高可以采用分步稀釋的方法。 避免進行長時間的孔內(nèi)稀釋，因為這樣會造成前后樣品反應(yīng)時間的差異， 影響到板內(nèi)的均一性。

3.2 樣品或液體的添加樣品或液體的添加其實就是將液體從樣品管、 稀釋板或加樣槽中轉(zhuǎn)移到包被板中。這一步操作關(guān)鍵是正確及規(guī)范正確使用移液器， 需要注意的是在將液體加至包被板的微孔中時避免產(chǎn)生氣泡或?qū)⒁后w加在管壁上部，另外在添加液體后避免用微旋振蕩器進行混勻， 此細節(jié)針對不同工藝的產(chǎn)品會產(chǎn)生不同程度的影響。

3.3 孵育孵育就是抗原抗體反應(yīng)的過程。 不同的產(chǎn)品所設(shè)計的孵育溫度有25℃、 37℃等，孵育時間有10、 15、 30、 60分鐘等。 先是要確保孵育的溫度和時間正確無誤，另外需要注意的是， 孵育時防止微孔板被的液體蒸發(fā)產(chǎn)生濃縮效果， 使整個實驗本底升高，為了避免這個問題通常采用濕盒或封板膜。 另外就是需要考慮孵育時包被板內(nèi)的液體受熱的時間、 速度及均一度。

3.4 洗板液的主要成分是表面活性劑， 其主要的作用是洗掉沒有參與反應(yīng)的或非特異性結(jié)合的物質(zhì)。洗板也是ELISA實驗操作中影響比較大的一步，但是現(xiàn)在大多使用洗板機， 其認為操作帶來的影響就大大減小。 如果采用手工洗板方法需要注意以下幾點：洗滌液的稀釋倍數(shù)及稀釋所使用的溶劑， 添加洗滌液的體積， 浸泡時間和洗板次數(shù)。每一個因素都會直接影響到試劑的性能。

3.5 終止反應(yīng)終止液的成份主要取決于酶及底物的成份， 常用的終止液有氫氧化鈉、氟化氫或硫酸， 這些液體都具有很強的腐蝕性， 使用時要注意安全，如果濺到眼睛或皮膚需要及時處理。 在實驗過程中要在正確的時間進行終止， 終止之后孔內(nèi)液體的顏色相對比較穩(wěn)定，但是也會緩慢的變化， 有時候孔內(nèi)會緩慢產(chǎn)生沉淀同時孔內(nèi)顏色變淺， 需要及時進行讀值。

4.數(shù)據(jù)讀取及分析

4.1 數(shù)據(jù)的讀取ELISA實驗數(shù)據(jù)的讀取需要使用酶標儀。酶標儀在使用之前需要預(yù)熱30分鐘以上， 讀數(shù)時注意選擇正確的波長。酶標儀讀數(shù)常采用單波長或雙波長兩種方式， 如果條件允許盡可能選擇使用雙波長。 因為雙波長讀數(shù)可以消除孔內(nèi)非特異性反應(yīng)所帶來的對發(fā)射光的吸收值，如果使用單波長， 則這些影響因素可能對檢測結(jié)果帶來影響。

4.2 數(shù)據(jù)的分析實驗數(shù)據(jù)的分析分為COV值的計算及結(jié)果判斷和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析兩個部分。 COV值的計算方法不同試劑盒差異較大， 有直接采用固定值或臨界對照、陰性對照加上或乘以一個系數(shù)、 陽性對照乘以一個系數(shù)或者計算標準曲線等， 總之嚴格參照說明書的要求進行結(jié)果判斷，有些計算方法或公式在酶標儀上無法直接設(shè)置的就需要進一步電腦換算。 另外， 有些試劑盒還需要設(shè)置空白對照［1］，需要將樣品孔的吸光度值減去空白對照孔后進行COV值計算。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析主要根據(jù)實驗?zāi)康目梢赃M行板內(nèi)重復(fù)性分析（一般是計算變異系數(shù)）， 批間差異分析 （一般進行相關(guān)性分析），不同產(chǎn)品的檢測結(jié)果差異分析 （計算Kappa值或進行卡方檢驗），實驗數(shù)據(jù)的長期觀察分析 （需要進行畫圖進行趨勢分析） 等。

5. 總結(jié)ELISA檢測技術(shù)看似比較簡單，但是每一個部分、 步驟或因素均可能影響到整體的實驗結(jié)果， 如果展開將是一個比較大的課題，在此本人只是將一些關(guān)鍵的環(huán)節(jié)點到為止。 ELISA檢測的很多細節(jié)還需要在實際工作中不斷的摸索、思考和總結(jié)。