一管式點突變試劑盒是高品質的基因結構和功能產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于生化實驗研究等領域，本品質量穩定，價位合理，需要一管式點突變試劑盒等基因結構和功能產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括一管式點突變試劑盒在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：一管式點突變試劑盒
英文名稱：One-Tube Mutagenesis Kit
產品貨號：BTN100212
產品規格：10次

基因的定點突變是重要的分子生物學技術，廣泛用于載體構建、基因改造、蛋白質功能研究等領域。但傳統的方法需要使用單鏈DNA 模板，而得到單鏈DNA 模板又需要先將基因克隆到類似M13 這種載體中，操作過程冗長。為了克服這些缺點，本公司將突變位點設計到一對互補的引物中，用高保真擴增質粒模板，然后用Dpn I 去除原始的甲基化模板，新合成的DNA 通過互補形成帶切口的雙鏈質粒，直接用于轉化感受態細菌。

產品特點：
1. 直接使用質粒DNA作為模板，免去了制備單鏈DNA的步驟。
2.基于高保真PCR，對模板DNA 序列沒特殊要求，可以用于突變任何序列。同時對模板的需求量很少。
3.一管式，全部在一個優化的緩沖體系中完成，非常簡單。
4. 使用Dpn I 去除未突變模板，突變效率高達90%。
5.可用于制備點突變，缺失突變和插入突變。
6. 本產品A型適用于8 kb以下，B型適用于8-15 kb。

試劑盒組成：

成分	10T(A型)	10T(B型)
高保真酶A型	10μl	無
高保真酶B型	無	10μl
5×高保真酶Buffer A型	100μl	無
5×高保真酶Buffer B型	無	100μl
dNTP(2.5mM each)	50μl	50μl
Dpn I酶	10μl	10μl
超純水	1ml	1ml

儲存條件：低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、引物設計及注意事項
用于特定基因突變的引物必須用戶單獨設計，請參考如下一些基本原則進行設計。
1. 共需設計兩條完全互補的一對引物，它們覆蓋要擴增的突變區位點，突變位點zuì好放在引物的中心。可以先集中設計一條，然后就可得互補的另一條引物。
2.引物的長度通常為25-45個堿基。引物中突變位點任何一側都必需滿足Tm大于45的條件，Tm 計算方式為Tm=4×(GC 堿基數)＋2×(AT 堿基數)。例如引物agtcaggccaattcgAAGcagtcgaattgccaag 就達到此標準，它的突變位點AAG 所放位置使左側Tm＝46；右側Tm＝48，均大于45。
3. 盡量把引物的GC含量控制在40％-60％，結尾的1-3個堿基zuì好是G或C。
4. 盡量使引物不要產生非常穩定的二級結構和引物二聚體。
5. zuì好使用經過PAGE 純化的引物或更高純度的引物。

二、待突變模板質粒的選擇
1. 必需使用從dam＋的大腸桿菌(這類菌中質粒可以被甲基化)中抽提得到的質粒用于基因定點突變，否則Dpn I 不能把沒有酶切的質粒DNA 切除，產生大量的假陽性。常用的大部分大腸桿菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。不能使用JM110和SCS110以及其它dcm-菌種。
2. 待突變質粒和目的基因的GC含量應該在40-55％，沒有任何GC含量超過70%、長度在50bp以上的區域。如果質粒GC含量過高，請先把目的基因克隆到其它合適的載體上，再進行基因定點突變反應。如果目的基因GC含量過高，而突變位點不在高GC含量區域，可以先把該基因的不含高GC含量的一個區域克隆出來，進行定點突變，然后再把突變后的片斷克隆回原基因中。如果突變位點在高GC 區，則可以使用高GC 專用PCR反應試劑。

三、基因定點突變反應
1.在一個塑料離心管中加入下列成分：

待突變模板質粒	0.1-0.5μg
5×高保真酶Buffer	10μl
引物一(10-20 uM)	1μl
引物二(10-20 uM)	1μl
dNTP Mix(2.5mM each)	4μl
補水到	49μl

2. 加入1μl高保真DNA聚合酶，混勻，如果PCR儀沒有熱蓋則需要加少量石蠟油。放入PCR儀器中按下面參數進行PCR：

步驟	溫度	時間	循環數
變性	95℃	1min	1次
PCR	95℃	40s	18次
	60℃	1min
	68℃	1min/Kb
延伸	72℃	10min	1次
保存	4℃	長時間保持

四、Dpn I消化
PCR反應后，直接在PCR反應體系中加入1μL Dpn I內切酶(該酶在甘油保存液中會下沉到管底，故用前需要充分混勻)。DpnI可以酶切雙鏈都被甲基化的模板質粒，也能降解一條鏈被甲基化的雙鏈質粒。混勻后37℃孵育2小時后樣品可以直接用于轉化，或者-20℃保存備用。

五、轉化、挑克隆鑒定：
每100 微升感受態細菌(轉化效率必須在107/μg以上)中可以加入5-10微升經過Dpn I 消化后的突變產物，按照所使用的感受態細菌的操作方法進行操作。如果PCR 使用了石蠟油，在轉化時千萬別把它帶入轉化反應，否則會嚴重影響轉化效率。
在涂板前通過離心濃縮的辦法，把所有被轉化后的細菌全部涂布到含有適當抗生素的平板上培養過夜。通常會得到50個以下的克隆，可按常規方法制備質粒并測序。

六、常見問題：
1.轉化后沒有克隆或克隆數少：
(1)感受態細菌效率不夠高，請檢測一下感受態細胞的效率，確保轉化效率在107/μg。
(2)把Dpn I 消化后的產物用常規的乙醇沉淀濃縮，這樣就可以把所有的產物全部用于轉化。
(3)優化基因定點突變中的PCR參數。可以把zuì初的95℃變性時間延長為2分鐘，循環中95℃變性的時間延長至1分鐘，把循環中的68℃的延伸時間改為1.5分鐘/kb 至2分鐘/kb，退火可以改為60-55℃或65-55℃等的touch down，退火時間也可以適當延長。
(4)引物設計有問題。通過突變反應中的PCR 沒有很好地擴增出預期的突變質粒。
2.有克隆，但沒有或很難檢測到預期的突變克隆：
使用的待突變的模板質粒量過多，導致Dpn I 消化時不完全，可減少質粒用量。
3. 有突變克隆，但突變位點不是預期的位點：
(1)引物設計不佳，退火溫度過低，導致引物退火到錯誤的地方。
(2)引物質量較差，沒有經過PAGE 純化。這樣引物中通常會含有比設計的引物要短的特異性較差的引物，容易導致非預期的突變。

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名稱：ACVR2A mRNA原位雜交試劑盒
貨號：ZN0022
規格：100T
基本信息：
保存條件：4℃保存一年
工作量：100張切片。
有效期：一年。
適用種屬：human
標記方式：3’—尾段標記
試劑盒中內容：
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml；
2.預雜交液 2ml；
3.ACVR2A mRNA原位雜交試劑盒寡核苷酸探針雜交液 2ml；
4.封閉液 5ml；
5.生物素化鼠抗地高xīn 5ml；
6.SABC-POD 5ml；
7.生物素化過氧化物酶 5ml。
用戶自備試劑：
原位雜交專用蓋玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油
緩沖液(3%檸檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC,原位雜交用 PBS)
一．培養細胞和冰凍切片
準備工作：
固定液：4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)；1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%檸檬酸——100ml蒸餾水中加檸檬酸(C6H8O7?H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉(C6H5O7Na3?2H2O，分子量294)8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸餾水即可。
原位雜交用PBS(1000ml蒸餾水加氯化鈉30g,Na2HPO4?12H2O 6g,NaH2PO4?2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序：
注意：zuì重要的是及時固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC處理，以抑制RNA酶對mRNA的分解作用。此外，過度固定對原位雜交有明顯的不利影響。
1．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．細胞在多聚賴氨酸處理的蓋玻片上進行培養，條件為37℃和5%的CO2，所用培養基為Dulbecco基礎培養基。細胞長好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分鐘×3次。
3．培養細胞和冰凍切片均可用下述方法固定：固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 20--30分鐘。蒸餾水充分洗滌，干燥后-20℃冰凍可保存2周以上。
4．30%H2O2 1份+純甲醇50份混合，室溫處理30分鐘。蒸餾水洗滌3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化5—120秒鐘。有時也可以不消化。原位雜交用 PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。
6.后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液為1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)，含有1/1000 DEPC。室溫固定 10分鐘。蒸餾水洗滌3次。
7．預雜交：濕盒的準備——干的雜交盒底部加20%甘油20ml以保持濕度。按每張切片20μι加預雜交液。恒溫箱38-42℃2—4小時。吸取多余液體，不洗。
8．雜交——按每張切片20μι雜交液，加在切片上。將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱38-42℃雜交過夜(根據雜交情況可以調節)。
9．雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37℃左右水溫的2×SSC洗滌5分鐘×2次；37℃0.5×SSC洗滌15分鐘×1次; 37℃0.2×SSC洗滌15分鐘×1次(如果有非特異性染色，重復0.2×SSC洗滌15分鐘×1-2次)。
10.滴加封閉液：37℃30分鐘。甩去多余液體，不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高xīn：37℃ 60分鐘或室溫120分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
12.滴加SABC：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×3次。勿用其它緩沖液和蒸餾水洗滌。
13.滴加生物素化過氧化物酶：37℃20分鐘或室溫30分鐘。原位雜交用PBS洗5分鐘×4次。
14.DAB顯色：使用DAB顯色試劑盒—1ml蒸餾水加顯色劑Ａ，Ｂ，C各一滴，混勻，加至標本上。一般顯色20-30分鐘。若無背景出現則可繼續顯色。也可自配DAB顯色劑后顯色。充分水洗。
15.必要時蘇木素復染，充分水洗。
16.酒精脫水，二甲苯透明，封片。
二．石蠟切片
如果有條件的話，應盡可能地采用新鮮標本。標本離體后，及時予以固定。固定液為4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6)，含有1/1000 DEPC。標本較大時用刀片切成厚度不超過4mm的小塊，固定1小時即可，較大的標本固定不要超過2小時。某些組織對過度固定尤其敏感，如動物大腦，固定時間30-40分鐘，一般不要超過1小時。
1．常規脫水、浸蠟、包埋。切片厚度6-8μm。
2．玻片的處理：一般采用多聚賴氨酸或APES。
3．石蠟切片經常規脫蠟至水。30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫5-10分鐘以滅活內源性酶。蒸餾水洗3次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(1ml 3% 檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，37℃或室溫消化3--30分鐘(視標本新舊、厚薄自行調整)。用戶可以比較不同的消化時間，例如5分鐘,10分鐘，20分鐘，30分鐘。以找到zuì佳的消化時間。原位雜交用PBS洗3次×5分鐘。蒸餾水洗1次。其余步驟和冰凍切片6-16步相同。
結果觀察：
ACVR2A的細胞胞漿著色呈棕黃色。
注意事項：
由于特定的mRNA序列僅占總mRNA的少數，加上基因僅由四個堿基排列組合而成，因此原位雜交容易出現非特異性染色。通過不加探針和用陰性標本做對照，基本可以確定染色是否為特異性的。有明顯的非特異性染色現象時，用預雜交液對含探針的雜交液進行稀釋，一般稀釋2—10倍；并應加強探針雜交后的洗滌。如果有少量的細胞核著色屬于正常情況；如果出現大量的細胞核著色，往往和標本固定時間過長有關，應重新處理標本。

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