柱式動物線粒體DNA提取試劑盒由北京百奧萊博供貨并提供相關技術服務支持，本品用于科研目的，本產品質量好，且具價格，深為用戶稱道，了解更多柱式動物線粒體DNA提取試劑盒等DNA提取純化產品請聯系我司咨詢訂購。...

特別提示：包括柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(測序級)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(測序級)
英文名稱：Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade)
產品貨號：BTN120501
產品規格：15次

本試劑盒就是基于先純化動物細胞線粒體、再從中柱式法純化其DNA的兩步法試劑盒。

試劑盒特點：
1. 即開即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優化各種條件。
2. 兩步法，先純化線粒體，再柱式法純化其中的DNA，有粗提(mtDNA純化前不用DNase處理線粒體)和精提(mtDNA純化前用DNase處理線粒體)兩套操作方案，適合于各種要求不同的后續實驗。
3. 本產品一次可以處理約107×108個培養細胞，10mg培養細胞(相當于5瓶150 mm培養細胞)可以純化到到0.2-0.5mg線粒體。
4. 本產品適用于各種動物懸浮培養細胞和貼壁培養細胞，不建議用于動物實體組織。
5. 提供線粒體染液，可以在操作中隨時監測純化過程中線粒體的完整性。

試劑盒組成：

成分	規格	備注
溶液A	225ml	配制勻漿液
蔗糖	25.4g	配制勻漿液
詹納斯染色液	1ml	染色線粒體
溶液B	0.5ml	配制核酸酶反應液
DNase A干粉	1mg	酶切細胞核DNA
Benzonase(1U/μL)	100μl	酶切細胞核DNA
溶液C	10ml	純化mtDNA
溶液D	5ml	純化mtDNA
溶液E	20ml	純化mtDNA
離心吸附柱	15套	純化mtDNA
通用洗柱液	15ml	純化mtDNA
DNA洗脫液	10ml	純化mtDNA
人TPMT VNTR	上游引物	GCT CCG CCC TGC CCA TTT
	下游引物	GCC TCC GCC ACC AAT GAC
人線粒體HV2區	上游引物	GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C
	下游引物	CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸和保存，保存期限一年。

使用方法：
注意：線粒體膜對溫度高度敏感，所以整個操作必須在冰上或冷室進行，所要用到的溶液和離心管都必須預先冷卻，否則線粒體容易破裂。

一：線粒體粗提
1. 稱25.4g蔗糖到225mL溶液A中，蓋上蓋子后充分搖晃3～5分鐘溶解即得250mL溶液A工作液，放冰上預冷待用。未用完的溶液A工作液需要-20℃保存，否則會長菌。
2. 如果是單層細胞，先用20mL PBS緩沖液洗滌107×108個培養的單層細胞，共洗滌2次。然后用塑料刮匙刮下細胞，重懸在20mL PBS緩沖液中。如果是懸浮細胞，則1000g 4℃離心10分鐘收集107×108個細胞，再用20mL PBS緩沖液洗滌2次，zuì后將細胞重懸在20mL PBS緩沖液中。
3. 用平甩轉子(swinging-bucket rotor)離心機1000 g 4℃離心10分鐘，吸棄上清，保留細胞沉淀。
4. 加入5倍體積(以細胞沉淀的體積為基數)的溶液A工作液，輕柔重懸細胞。
5. 如果是成纖維細胞，由于其難于裂解，可將細胞重懸液在-80℃放置20-30分鐘后再化凍，然后進入下步操作。如果不是，則直接進入下步操作。
6. 將細胞重懸液體轉移到預冷的Dounce玻璃勻漿器中(工作體積為10-15mL，間隙為0.12 mm，zuì好是玻璃材質，否則線粒體產率會降低)勻漿適當次數。細胞株不同，其zuì適勻漿次數不同，一般需要40次-60次左右。勻漿是線粒體純化zuì關鍵的步驟，故勻漿前zuì好先通過預實驗確定zuì適勻漿次數，方法是每勻漿5-10次后，取2-3μl勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細胞數量降低到20-50%以下為佳。
7. 用平甩轉子離心機4℃ 1000 g離心10分鐘。沉淀含殘留完整細胞、細胞碎片和細胞核，上清液含線粒體。
8.轉移上清液到離心管中，冰上放置待用。如有必要，可在顯微鏡下檢測上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴一滴上清液到載玻片上，再滴入50μl詹納斯染液染色20分鐘，油鏡下觀察，藍綠色顆粒狀物即為線粒體。
9. 用固定角度轉子(fixed-angle rotor)離心機4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清，所得棕黑色沉淀即為粗提線粒體沉淀。
10. 用5mL溶液A工作液洗滌2次得線粒體粗提液(即重懸后，4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清)。
11. 如果后續實驗是提取mtDNA用于PCR或Southern雜交，則直接進入第3部分mtDNA提取，也可以放-80℃長期保存待用。
12. 如果后續實驗是提取mtDNA用于高通量測序，則必須徹底降解掉其中的細胞核DNA污染。勻漿過程中一個破裂的細胞核釋放出的DNA相當于上百萬個線粒體的DNA量之合，所以無論如何小心，粗提線粒體中必有大量的細胞核DNA污染，如果不將其清除，高通量測得的序列將大部分來于核DNA而非mtDNA。

二：線粒體粗提液中細胞核DNA的去除及鑒定
13. 將線粒體重懸于0.3mL溶液A工作液中，取10μl作為未處理對照。
14. 加入6μl Benzonase(1U/μL)溶液和30μl DNase A溶液(配法：將0.5mL溶液B加到裝有1mg DNase A干粉的離心管中得到2mg/mL溶液，未用完的部分需要分裝后放-20℃保存)。
15. 37℃保溫一段時間酶切細胞核DNA。注意：zuì好先預實驗，每隔一段時間取10μl樣品，滅活其中的DNase后作為模板用PCR擴增1-4個自選的VNTR位點和1-2個mtDNA基因(如vis或COII基因)，檢測不到VNTR基因而能檢測到mtDNA基因的處理時間為zuì佳?？蓮谋竟玖碣徏毎嘶蚝途€粒體基因專一性引物。
16. 加入10μl自備的0.5M EDTA溶液(pH8.0)以終止酶反應。顯微鏡下檢查線粒體完整性(見上節第8步)。
17. 用固定角度轉子離心機4℃10000 g離心10分鐘，棄上清。
18. 用1mL的溶液A工作液洗滌沉淀(即重懸后，4℃ 10000 g離心10分鐘，棄上清。此為一次洗滌。)2次得到線粒體沉淀。

三：線粒體DNA提取
19.在不超過100μl的線粒體沉淀中加入600μl預熱的溶液C到沉淀中，充分吹打均勻。
20. 再加入150μl(可稱150-160mg)預熱的溶液D到離心管中，顛倒數次混勻。此時溶液中可能有白色絲狀懸浮物產生。
21. 65℃放置3～5分鐘。
22. 加入200μl自備lǜ仿，震蕩混勻10-30秒，此時溶液將呈乳白色。
23. 12000～15000g室溫離心2分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉移上清液到一個新的1.5mL塑料離心管中，避免觸及中間的白膜。
24. 加入1.5倍體積的溶液E，顛倒混勻后全部轉移到離心吸附柱中，室溫放置至少2分鐘。
25. 12000rpm室溫離心1分鐘，棄收集管中的穿透液。
26. 通用洗柱液洗滌2次(將0.5mL加入離心柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄穿透液，此為洗滌一次，再重復一次)。
27. 空甩半分鐘去除殘留液體,將離心吸附柱轉移到新的1.5mL離心管中。
28. 加30-50μl DNA 洗脫液，室溫放置3～5分鐘。
29. 12000rpm室溫離心1分鐘即得純化的mtDNA溶液。

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名稱：土壤腐殖酸清除劑
貨號：BTN70603
規格：250mL
土壤和湖海沉積物中都含有棕黑色或黑色的腐殖酸，它們對PCR等后續反應有大的抑制作用，所以有效去除土壤中腐殖酸是提取土壤微生物DNA的重要環節。但是目前市場上沒有專門的產品，針對這一情況，百奧萊博開發了本產品，專門用于對提取DNA用的土壤進行預處理，以清除腐殖酸成分。

產品特點：
1. 清除效果好，一次能使腐殖酸的濃度降低50%左右。
2.適合于黃色、紅色、黑色和棕黑色等各種質地的土壤和河海沉積物。
3. 操作過程簡單快速，一次處理只需要10分鐘。
4.擴容性好，可小規模操作，也可以大規模操作。

儲存條件：常溫運輸和保存，有效期一年。

使用及效果：
按每1克土壤加10mL本產的比例將樣品混合，振蕩3～5分鐘，3000-5000g室溫離心5分鐘，棄上清，沉淀可直接用于DNA提取。此操作可以多次重復。

圖注：比較水和本產品處理泥碳(腐殖酸含量大于60%)樣品的效果，C為用水處理后離心得到的結果，1-5是同一土壤樣品用本產品洗滌1-5后所得到的上清液。

圖注：用我司土壤DNA提取試劑(BTN60701)提取泥碳樣品所得到的DNA溶液，1號樣品所用土壤預先用水洗滌過三次，2號樣品預先用本產品洗滌過三次。

名稱：痰液采集器
貨號：BTN130938
規格：1個

名稱：一管式拭子DNA提取試劑盒
貨號：BTN60501
規格：100次
本試劑盒專門用于從口腔拭子中快速提取能夠用于PCR的基因組DNA。也可以用于提取微量血液，精液，血斑/精斑等法醫物證的DNA。

產品特點：
1.快速，整個操作過程只需要十分鐘，在一個離心管中完成。
2. DNA樣品可直接用于PCR反應。
3.樣品可以在4℃長期保存。
4. 不需要使用任何有毒的試劑。
5. 高。

試劑盒組成：

成分	規格
無菌拭子	100只
1.5mL離心管	100只
溶液A	50ml
溶液B	10ml
說明書	1份

儲存條件：常溫運輸及保存。有效期一年。

使用方法：
1. 將醫用棉球拭子涂抹面頰的口腔內表面約十次，放入加有0.5mL溶液A的1.5mL塑料離心管中。
2. 剪去口腔拭子柄部，留藥棉頭于離心管中，蓋上離心蓋后振蕩一分鐘。
3. 95℃保溫5分鐘，用鑷子取出離心管中藥棉頭，并在離心管壁盡量擠出其中的液體。
4. 加入50μl的溶液B，振蕩半分鐘。
5.室溫12000 g離心2分鐘。
6. 直接取上清作為模板加入到PCR反應體系中進行擴增，所加量以PCR的總體積的1/５為宜(即50μl的PCR 體系加10μl處理液)。
7. 剩余樣品放4℃保存。

使用效果：

圖注:用本產品提取涂抹面頰后的拭子的口腔上皮細胞DNA，zuì后分別取5μl(5號樣)和10μl(10 號樣)作為模板進行PCR,反應完后取10μl上樣電泳。擴增片段為人-actin基因，長度為610bp，M表示100bp DNA Ladder，zuì大片段為600bp。電泳在SuperBuffer-2中進行，300 V，5分鐘。

疑難解答：
Q：能否濃縮第六步上清中的DNA？
A：可以用鹽/乙醇法濃縮DNA，用濃縮后的DNA做模板擴增效果更好。

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