超級雜交液(不含甲酰胺)是高品質的探針標記及檢測產品，由北京百奧萊博供應，本產品用于科學研究，本品質量穩定，價位合理，需要超級雜交液(不含甲酰胺)等探針標記及檢測產品的客戶，請到我公司官網聯系我們。...

特別提示：包括超級雜交液(不含甲酰胺)在內，本公司的所有產品僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫療及其他非科研用途！

產品名稱：超級雜交液(不含甲酰胺)
英文名稱：Super hybrid solution(formamide free)
產品貨號：BTN8091
產品規格：100mL

核酸雜交一般是指用一種標記的核酸探針與印跡膜上的核酸進行雜交，由此檢測印跡膜上是否存在與探針同源的核酸分子(靶分子)。核酸雜交是分子生物學的基本技術之一，應用非常廣泛。由于核酸雜交效率受印跡膜種類、雜交溫度、探針濃度、雜交液離子強度、雜交液pH及雜交液粘度等因素影響，用戶自己摸索和優化相關條件非常繁瑣，因此本公司開發了本產品，其操作流程如下：


產品特點：
1. 既可用于Southern雜交(靶分子為DNA)，也可用于和Northern雜交(靶分子為RNA)，還可以用于菌落雜交，基因芯片等雜交。
2. 既可以用于同位素探針的雜交，也可以用于非同位素探針的雜交。
3. 既可以使用DNA(包括DNA Oligo)探針，也可以使用RNA探針(包括RNA Oligo)
4.含多種能夠促進雜交的聚合物，使雜交反應能在6～12小時完成，而常規雜交反應一般需要12～24小時。
5.含多種封堵劑，能阻印跡膜對探針分子的非特異性吸附，能有效降低背景信號，延長曝光時間以便檢測到低拷貝的RNA(Northern)和單拷貝的基因(Southern)。
6. A型不含甲酰胺，B型含50%的甲酰胺。后者使雜交在較低溫度就可以完成，適合Tm 較高的分子雜交(如RNA-RNA和RNA-DNA雜交)。
7.跟各種常用的印跡膜兼容，包括硝酸纖維素膜和尼龍膜。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。本產品屬于高鹽溶液，低溫下產生沉淀，必須在65℃加熱溶解并充分搖勻后才能使用。

使用方法：

一、根據探針和靶分子的不同，分別按下面不同情況計算雜交分子的Tm 值
1. 對DNA-DNA雜交，其Tm = 81.5 + 16.6×log10[Na+] + 0.41×GC%–500/L
說明：L是探針或靶分子的長度(用兩者中zuì短的一個)
GC%是探針或靶分子中的GC 百分比(用兩者中zuì短的一個)
Na+濃度是本產品中Na+的濃度，為0.75 M，16.6 ×log10[Na+]=(-2.07)
2. 對DNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高10-15℃。
3. 對RNA-RNA雜交，其Tm 值比DNA-DNA的Tm 值要高20-25℃。
4. 對Oligo探針雜交，Tm=GC 數量×4℃+AT 數量×2℃。

二、確定zuì佳雜交溫度(預雜交溫度跟雜交溫度應該一樣)
1. 對于大于200bp的DNA-DNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃，一般選擇68℃。
2. 對RNA-RNA或DNA-RNA雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低15-25℃。如果這樣計算出的雜交溫度很高(如高于70℃)，則RNA容易降解，所以zuì好選用含甲酰胺的超級雜交液(B型本產品)，以便能在42℃完成雜交。
3. 對Oligo探針的雜交，zuì佳雜交溫度一般比Tm低5℃。由于Oligo較短，更容易受各種因素影響(如錯配率、修飾堿基比例等)，所以zuì佳溫度需要適度摸索和優化。

三、確定洗膜溫度
一般使用0.1×SSC做洗膜液，在此條件下的zuì佳洗膜溫度比Tm低5-12℃，一般情況下可以在55℃進行洗膜。Oligo探針可以室溫洗膜。

四、預雜交步驟
預雜交就是用不含探針的本產品跟印跡膜進行孵育，其目的是用所含的非特異性DNA分子(鮭精DNA或小牛胸腺DNA)及其它高分子化合物將印跡膜上會非特異地吸附探針分子的位點封閉，否則這些位點會吸附標記的探針，造成高背景。
1. 將結合了靶分子的硝酸纖維素印跡膜或尼龍印跡膜浸泡于自備的6×SSC溶液中，使其充分濕潤。
2. 將濕潤的印跡膜置于一塑料雜交袋中(塑料袋zuì好預先封口，再剪掉一角，留一個小口)，按每平方厘米印跡膜加0.2mL超級雜交液的比例沿小口加入超級雜交液，然后用塑料封口機將口封牢。
3. 將此塑料袋浸沒入溫度設定在zuì佳雜交溫度的恒溫水浴中或雜交爐中，保溫1-2小時，延長到12-16小時亦可。注意保溫過程中塑料袋應在不停的搖動狀態中，使超級雜交液與印跡膜充分接觸。

五、雜交步驟
1. 如果標記的探針是雙鏈核酸，則需經變性處理。具體操作是將探針樣品在沸水浴中加熱5分鐘，然后迅速置冰浴中。如果是單鏈DNA或RNA探針，則不需變性，直接使用。
2. 將單鏈探針或變性后的雙鏈探針加入到完成了預雜交的雜交袋中(先用剪刀剪一小口，加入探針后用熱封機封口)。探針的加入量視探針標記效率而定，一般要求終濃度不能低于1-2 ng/mL。如果檢測基因組中的單拷貝基因，探針的加入量應加大，而對于檢測克隆的基因片段，則探針的量可減少。如果是放射性探針，應將此塑料袋套在另一塑料袋之中，以避免雜交袋發生遺漏、污染工作環境。
3.在選定的雜交溫度下繼續保溫，時間一般為6-12小時。

六、洗膜步驟。注意在下面的所有操作過程中，一定不要使印跡膜干燥。
此步是將與印跡膜非特異結合的探針分子洗去而只留下特異結合的探針分子。由于非特異性雜交的雜交分子解鏈溫度較低，熱穩定性較差，在一定的溫度和較低的離子強度下，即可洗掉。
1.雜交完畢，取出塑料袋，剪去一角，倒出所有的含探針的雜交液。此含探針的雜交液可以多次使用再倒棄。
2. 剪開雜交袋，用鑷子取出印跡膜，浸沒于大量的2×SSC(含0.5%SDS)溶液中，室溫下振蕩漂洗15分鐘。
3. 重復上步操作一次。
4. 將印跡膜轉移至0.1×SSC(含0.1% SDS)溶液中，在計算好的洗膜溫度下振蕩漂洗30分鐘至1小時。
5. 重復上步操作一次。如果是同位素標記探針，則需要重復至用蓋革計數器在無核酸區域檢測不出放射信號為止。
6. 將印跡膜轉移到濾紙上，吸去表面液體后印跡膜即可用于后續檢測。

疑難解答：
問題一：高背景(有或沒有雜交信號)
解決方案：將放射性探針的比活降低到2×10E6 cpm/mL以下；將非放射性探針的終濃度降低到30 ng/mL以下；將探針長度控制在200–800 核苷酸；減少雜交時間；適當提高雜交溫度。
問題二：沒有雜交信號或雜交信號非常弱
解決方案：雜交過程中應應該連續振蕩，不應該有氣泡，避免印跡膜變干。將放射性探針活性提高到>5×10E8 cpm/ng，提高非放射性標記探針的終濃度；適當降低雜交溫度。

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名稱：PCR法DNA探針dì高辛標記試劑盒
貨號：BTN90604C
規格：5次
PCR標記的原理是用帶標記的dNTP進行PCR，zuì后得到的PCR產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。其原理示意圖如下：


產品特點：
1.一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠10次50μl體系的常規PCR(用于制備標記反應的模板和設置對照反應)和5次50μl體系的標記反應。
3.一次標記可以得到μg級的雙鏈DNA探針或約700ng的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. 90604A需自備含標記核苷酸的dNTP，90604B和90604C分別含生物素和dì高辛標記的底物。自備的標記包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6. 本產品得到的探針參入率一般為4-5%(每100個核苷酸中有4-5個將帶有非同位素標記)，有效降低了空間阻礙，檢測效果zuì佳。
7.可以用于Southern和Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

試劑盒組成：

成分	規格
2×標記專用PCR Mix	500μl
dNTP，2mM each	50μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP	25μL(僅B有)
含DIG-11-dUTP的dNTP	25μL(僅C有)
超純水	1ml
說明書	1份

注：標記專用PCR Mix不含dNTP。

儲存條件：低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一：準備工作
1. 按常規的方法設計PCR引物，使探針長度在400-800bp之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 根據PCR引物優化PCR條件。
3. 由于標記的dNTP比較珍貴，所以本試劑盒不推薦以基因組DNA或其他復雜DNA為模板直接進行PCR標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記PCR產物，再以之為模板制備標記的PCR產物。
二：非標記PCR產物的制備
4. 設置50μL PCR的反應體系：

成份	用量
2×標記專用PCR Mix	25μl
dNTP，2mM each	5μl
自備的探針引物一(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的探針引物二(10pmol/μL)	1μL(10μM)
自備的模板DNA	1μg基因組DNA或1ng質粒DNA
超純水	補到50μL

5. 按已經優化的PCR參數進行PCR。
6.電泳檢測和膠回收所需的PCR產物，并定量。用10 pmol引物一般能得到1μg左右的PCR產物(具體取決于PCR產物的長度)。注意：zuì好采取膠回收而不是PCR回收以避免殘留引物干擾后續的標記PCR。
三：標記PCR反應(zuì好做一個不加標記的對照用于定量)
說明：在設置下面反應時，如果加一種引物，就得到單鏈標記的PCR產物；如果加兩種引物，則得到雙鏈標記的PCR產物。由于雙鏈PCR探針在雜交前雖然要變性成單鏈后使用，但雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，這種復性會與探針-靶DNA雜交反應相競爭，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記的DNA探針。

成份	樣品	對照
2×標記專用PCR Mix	25μl	25μl
含Biotin-11-dUTP的dNTP或 含DIG-11-dUTP的dNTP或 自備的含其他標記dUTP的dNTP	5μl	不加
dNTP，2mM	不加	5μl
雙鏈標記：探針引物一和引物二 單鏈標記：探針引物一或引物二	每種50 pmol 一種50 pmol	每種50 pmol 一種50 pmol
上步膠純化所得PCR產物 (單鏈標記可用100ng)	10 ng	10 ng
超純水	補到50μL	補到50μL

 注意：本試劑盒提供的dNTP混合物中，標記底物與非標記底物的比例已經進過優化，如果自備標記dUTP，其與dTTP的zuì佳比例需要優化，標記不同，比例不同。對DIG-11-dUTP，zuì佳比例1：3；對BrdUTP，zuì佳比例為1：1。
7. 按第5步的PCR參數進行標記PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到35-55個循環。由于模板為純化后的PCR產物，探針對擴增長度完整性要求不高(長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好)，所以可以增加循環數；二是延伸時間增加15秒，因為標記dUTP參入到DNA的速度比常規的dTTP慢；三是降低復性溫度5-7℃，因為標記核苷酸參入到DNA后，新模板的Tm值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應和對照反應的產物1-5μl，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的DNA marker一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記反應的PCR產物中額外帶有非同位素的配體(生物素，dì高辛等)、因此其泳動速度將慢于非標記PCR產物(但同位素標記不能用此法)。
 注意：如果擴增的是單鏈DNA探針，其結合EB的能力遠低于雙鏈DNA(EB是嵌合到雙鏈堿基對之間的，而單鏈DNA沒有堿基對，只有一些局部區域折疊形成的有限雙鏈區，因此能結合的EB很少)，因此EB染色的強弱不能準確反應DNA的濃度，可以采用銀染定量(跟marker比較)。一般100ng模板按上述條件經過單鏈PCR擴增可得到700ng左右探針。
9. 剩余的PCR標記產物可以不經過純化，直接加入(對單鏈PCR探針)雜或加熱變性并急冷后加入(對雙鏈PCR探針)到雜交液中使用。如果暫時不用請放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法。

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