Western Blot操作步驟和產品選擇指南

一、 Western blot 實驗步驟概述
1. 組織取材：組織塊稱重
2. 利用液氮、研缽粉碎組織塊 
3. 加入RIPA緩沖液(每克組織3 ml RIPA)，PMSF(每克組織30μl，10 mg/ml PMSF)，進一步勻漿(15,000轉/分*1分鐘)維持4℃ 
4. 加入PMSF，冰上孵育30分鐘
5. 移入離心管4℃ 約20,000 g(約15,000轉)15分鐘
6. 上清液為細胞裂解液可分裝-20℃保存
7. 進行BCA 蛋白定量或者Bradford比色法測定蛋白質濃度
8. 取相同質量的細胞裂解液(體積*蛋白質濃度)，并加等體積的2×電泳加樣緩沖液
9. 沸水浴中3分鐘 
10. 上樣 
11. 電泳(濃縮膠20mA，分離膠35mA)
12. 電轉膜儀轉膜(100mA 40分鐘)
13. 膜用超敏可逆蛋白膜染色，膠用考馬斯亮藍染色或者快速蛋白染色試劑盒
14. Westernblot 試劑盒顯色
15. 分析比較記錄
二、 Western具體實驗步驟
    Western，也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western可以參考如下步驟進行操作。
1.收集蛋白樣品(Protein sample preparation)
  可以使用適當的裂解液裂解貼壁細胞、懸浮細胞或組織樣品。對于某些特定的亞細胞組份蛋白，例如細胞核蛋白、細胞漿蛋白、線粒體蛋白等，可以參考相關文獻提取這些亞細胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進行抽提。
收集完蛋白樣品后，為確保每個蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個蛋白樣品的蛋白濃度。根據所使用的裂解液的不同，需要采用適當的蛋白濃度測定方法。因為不同的蛋白濃度測定方法對于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京百奧萊博科技有限公司生產的RIPA細胞裂解液，配套PMSF(100mM)苯甲ji磺酰氟，定量可以使用BCA蛋白定量試劑盒。
2.電泳(Electrophoresis)
(1) SDS-PAGE凝膠配制
  SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻資料進行配制，也可以使用北京百奧萊博生產的EasyPAGE 通用快速蛋白凝膠制備系統。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。
(2) 樣品處理 
  在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內可以上樣更多的蛋白樣品。2X或者5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關文獻資料配制，也可以使用北京百奧萊博生產的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。
(3) 上樣與電泳 
  冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內即可。電泳緩沖液可采用10×蛋白電泳緩沖液
  為了便于觀察電泳效果和轉膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，zui好使用預染蛋白質分子量標準（另購）。
電泳時通常推薦在上層膠時使用低電壓恒壓電泳，而在溴酚藍進入下層膠時使用高電壓恒壓電泳。對于Bio-Rad的標準電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設置在80-100V，高電壓可以設置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的電泳儀就可以滿足要求。為了電泳方便起見，也可以采用整個SDS-PAGE過程恒壓的方式，通常把電壓設置在100V，然后設定定時時間為90－120分鐘。設置定時可以避免經常發生的電泳過頭。
  通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離后即可停止電泳。

3.轉膜(Transfer)
  我們推薦在Western實驗中選用PVDF膜（另購）。硝酸纖維素膜(NC膜)也可以使用（另購），但硝酸纖維素膜比較脆，在操作過程中特別是用鑷子夾取等過程中容易裂開。膜的使用請參考生產商的推薦使用步驟。
   通常如果使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，可以設定轉膜電流為300-400mA，轉膜時間為30-60分鐘。也可以在15-20mA轉膜過夜。具體的轉膜時間要根據目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉膜時間越長，目的蛋白的分子量越小，需要的轉膜時間越短。
  在轉膜過程中，特別是高電流快速轉膜時，通常會有非常嚴重的發熱現象，zui好把轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。 轉膜的效果可以觀察所使用的預染蛋白質分子量標準，通常分子量zui大的1-2條帶較難全部轉到膜上。轉膜的效果也可以用超敏可逆蛋白染色試劑盒對膜進行染色，以觀察實際的轉膜效果和了解是否蛋白上樣量一致。也可以用快速蛋白染色試劑盒對完成轉膜的SDS-PAGE膠進行染色，以觀察蛋白的殘留情況。
4.封閉(Blocking)
  轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液10× 封閉/漂洗緩沖液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉膜液。從轉膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則易產生較高的背景。
用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入稀釋后10× 封閉/漂洗緩沖液，需要另外購買脫脂奶粉。在搖床上緩慢搖動,室溫封閉60分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以在4℃ 封閉過夜。
5.一抗孵育(Primary antibody incubation)
  參考一抗的說明書，按照適當比例用Western一抗稀釋液稀釋一抗。
  用微型臺式真空泵吸盡封閉液，立即加入稀釋好的一抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。如果一抗孵育一小時效果不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜?；厥找豢?。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
6.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
  參考二抗的說明書，按照適當比例用Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗。
  用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。
  回收二抗。加入Western洗滌液，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。
7.蛋白檢測(Detection of proteins)
  參考相關說明書，使用UltraECL, Western 熒光檢測試劑等ECL類試劑來檢測蛋白。 洗片時可以使用X光片自動洗片機。如果沒有自動洗片機，可以用顯影定影試劑盒自行配制顯影液和定影液進行手工洗片。
8.膜的重復利用(Membrane recovery)
  如果蛋白樣品非常寶貴，可以使用蛋白印跡膜再生液Stripping Buffer處理蛋白膜，以重復利用蛋白膜
三、實驗注意事項
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維膜上。
1)轉移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來回滾動去除所有的氣泡。
2)在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預先用轉移緩沖液浸濕)，將凝膠夾在中間，保持濕潤和沒有氣泡。
3)將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰。
4)將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉移緩沖液以淹沒凝膠。
5)按照廠家所示接通電源開始電泳轉移。
6)轉移結束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。 
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標準顯現時取出，記錄下標準位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時可用脫色緩沖液。 
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體(2.5-5毫升)，加在裝薄膜的袋中，于室溫下搖動2小時(或4℃過夜)
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次75ml。
10．將連接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)加在袋內，于室溫下搖動1小時。 
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS)，于室溫下搖動。 
13. western blot中轉移在膜上的蛋白處于變性狀態，空間結構改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于western blot檢測。這種情況可以將表達目的蛋白的細胞或細胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標記親和素進行western blot。實驗中取膠和膜需帶手套。 
四、 關于內參抗體
  眾所周知，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的蛋白上樣，才有比較的基礎。特別是在表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。所以需要內參做對比。
  內參即是內部參照(Internal Control)，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，以保證實驗結果的準確性。
  在國外發表的文章中，Western Blotting 實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯yi方法。然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。 蛋白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產生的誤差進行校正。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。
  實驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分，可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，至內參量一致為止；若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作。